基于DFT方法研究甘草中黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性

劉靖麗 權(quán)彥 閆浩

摘 ? ? ?要：基于密度泛函（DFT）方法研究甘草中黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性，對(duì)甘草素、甘草苷、異甘草素和異甘草苷4種化合物的分子結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)的自由基進(jìn)行了理論計(jì)算。分別在氣相和溶劑中獲得了4種化合物及其相應(yīng)自由基的最優(yōu)幾何結(jié)構(gòu)、NBO電荷、BDE和IP等量子化學(xué)參數(shù)。計(jì)算結(jié)果顯示：4種化合物的抗氧化活性由大到小的順序?yàn)楫惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，與實(shí)驗(yàn)活性順序一致，并且4種化合物中C7位是自由基反應(yīng)的最大可能活性位點(diǎn)。

關(guān) ?鍵 ?詞：甘草;黃酮類(lèi)化合物;抗氧化活性;密度泛函理論

中圖分類(lèi)號(hào)：O641 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）10-2163-05

Abstract： In order to study the relationship between the structure and antioxidant activity of flavonoids from licorice， the density functional theory （DFT） B3LYP method with 6-31+G** basis sets was used to optimize the structures of liquiritigenin， liquiritin， isoliquiritigenin， isoliquiritoside and the corresponding free radicals. The properties of the stable geometries were discussed on basis of the molecular geometries， the natural bond order （NBO） charges， the bond dissociation enthalpies （BDE）， ionization potential （IP） and the frontier molecular orbitals theory. The results revealed that the sequence of antioxidant activity of these four flavonoid compounds was： isoliquiritigenin> isoliquiritoside>liquiritigenin>liquiritin， which was consistent with the experimental conclusions. The calculated BDE values for flavonoid compounds clearly demonstrated that the site of C7—OH was the most active site.

Key words： Licorice; Flavonoid compound; Antioxidation activity; DFT

甘草為豆科植物甘草（Glvcyrrhiza uralensis Fisch.）的根及根狀莖，屬多年生草本植物，是一種補(bǔ)益中草藥，具有補(bǔ)脾益氣，祛痰止咳，清熱解毒，調(diào)和諸藥等功效[1]。近年來(lái)，相關(guān)學(xué)者對(duì)甘草進(jìn)行了大量的系統(tǒng)研究，其主要的化學(xué)成分為黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、香豆素類(lèi)、生物堿及多糖等，這些物質(zhì)具有廣泛的藥理活性[2]。

通過(guò)對(duì)甘草黃酮類(lèi)成分的藥理研究發(fā)現(xiàn)，甘草中黃酮類(lèi)成分具有抗氧化、抗?jié)?、抗腫瘤、抗HIV等作用[3-4]，因而具有潛在的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。醫(yī)學(xué)研究表明[5]，活性氧自由基與一些疾?。ㄈ缢ダ?、心血管疾病、炎癥、腫瘤等）的發(fā)生有關(guān)，因而開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑對(duì)預(yù)防這些疾病發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。傅乃武等[6]研究了甘草黃酮類(lèi)成分對(duì)活性氧的清除作用，實(shí)驗(yàn)表明甘草黃酮類(lèi)化合物具有顯著的抗氧化活性。隨后崔譽(yù)蓉[7]等測(cè)定了甘草中的4種黃酮類(lèi)成分甘草素、異甘草素、甘草苷和異甘草苷（分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）的體外抗氧化活性，并初步探討了4種化合物的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明，4種化合物的抗氧化活性順序?yàn)楫惛什菟?、異甘草苷、甘草素和甘草苷。課題組前期合成了異甘草素，研究了其體外抗氧化活性[8]。潘燕[9]等發(fā)現(xiàn)甘草水溶性總黃酮具有抗心肌缺血的活性，其機(jī)理是水溶性總黃酮可通過(guò)抑制自由基的生成，從而減少自由基對(duì)人體的危害，保護(hù)心肌受損。LEE[10]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草的甲醇提取物可保護(hù)細(xì)胞，免受氧化傷害，因而具有抗氧化的能力。AMAROWICZ[11]等通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘草的乙醇提取物對(duì)DPPH·和HO·自由基有清除作用，但是不同溶劑提取物對(duì)化合物抗氧化活性的影響未知。

隨著計(jì)算化學(xué)的發(fā)展，密度泛函（DFT）方法被用來(lái)研究分子的抗氧活性。WRIGHT等最先采用DFT方法計(jì)算了多酚類(lèi)抗氧化劑的量子化學(xué)參數(shù)酚羥基解離能（BDE）和絕熱電離勢(shì)（IP）[12]。本課題組前期運(yùn)用密度泛函理論方法研究了燈盞花乙素及其苷元[13]和黃芪中黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活 ?性[14]，同時(shí)模擬了溶劑對(duì)抗氧化活性的影響。雖然張?chǎng)蝃15]等采用DFT方法研究了甘草素、異甘草素、甘草苷和異甘草苷的抗氧化活性，通過(guò)量子化學(xué)參數(shù)初步分析和比較了4個(gè)化合物的抗氧化活性大小，但是他們只考慮了抽氫反應(yīng)機(jī)理，而沒(méi)有考慮電子轉(zhuǎn)移機(jī)理，也沒(méi)有考慮溶劑效應(yīng)對(duì)化合物抗氧化機(jī)理的影響。而在中草藥有效成分黃酮的提取和分離過(guò)程中，甲醇和乙醇是常用的溶劑，可能會(huì)對(duì)有效成分的活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響抗氧劑的抗氧化機(jī)理。為此，本文選取甘草中的4種黃酮類(lèi)化合物甘草素、異甘草素、甘草苷和異甘草苷為研究對(duì)象，比較直接的抽氫反應(yīng)機(jī)理和電子轉(zhuǎn)移機(jī)理，同時(shí)考慮溶劑效應(yīng)對(duì)抗氧化活性的影響，從原子水平的角度深入揭示4種甘草黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性關(guān)系，以期對(duì)中藥甘草的開(kāi)發(fā)利用和生物活性研究提供理論上的幫助。

1 ?計(jì)算方法

采用DFT（B3LYP）方法以6-31+G**為基組對(duì)4種黃酮類(lèi)化合物及其自由基的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行全優(yōu)化，對(duì)于閉殼層的分子選用限制性的計(jì)算，而開(kāi)殼層的自由基用非限制性的計(jì)算。分子的幾何平衡構(gòu)型通過(guò)頻率計(jì)算進(jìn)行驗(yàn)證，沒(méi)有虛頻，說(shuō)明得到的是能量極小值。最后對(duì)化合物及其相應(yīng)的脫氫自由基和陽(yáng)離子自由基進(jìn)行熱力學(xué)和NBO電荷計(jì)算，基于4種化合物酚羥基的O—H鍵長(zhǎng)、NBO電荷、鍵解離能（BDE）、電離勢(shì)值（IP）和前線分子軌道等量子化學(xué)參數(shù)，分析4種甘草黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系及規(guī)律。為了評(píng)估溶劑對(duì)化合物抗氧化活性的影響，以甲醇、乙醇和水為溶劑，采用PCM模型[16]對(duì)化合物及其自由基在水溶液中的結(jié)構(gòu)、頻率和NBO進(jìn)行了計(jì)算。所有計(jì)算均由Gaussian 16軟件包完成[17]。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?酚羥基的鍵長(zhǎng)

對(duì)于黃酮類(lèi)化合物來(lái)說(shuō)，它們是通過(guò)斷裂 ? ?O—H鍵而起抗氧化作用的，故而根據(jù)分子中O—H的數(shù)目和鍵長(zhǎng)可以初步推斷其抗氧化活性的強(qiáng)弱。通過(guò)對(duì)4種化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)異甘草素有3個(gè)酚羥基，異甘草苷和甘草素有2個(gè)酚羥基，而甘草苷只有1個(gè)酚羥基。根據(jù)化合物所具有的酚羥基的數(shù)目，推測(cè)異甘草素的清除自由基活性最強(qiáng)，甘草苷的自由基清除活性最弱。根據(jù)酚羥基鍵長(zhǎng)分析，計(jì)算結(jié)果列于表1。

根據(jù)分子價(jià)鍵理論：分子的鍵長(zhǎng)越短，鍵能越大，鍵越不容易斷裂，化學(xué)反應(yīng)也越不活潑，抗氧化活性也越低;反之，鍵長(zhǎng)越長(zhǎng)，抗氧化活性越強(qiáng)。因此通過(guò)鍵長(zhǎng)大小可以對(duì)反應(yīng)活性做初步的判斷。由表1鍵長(zhǎng)數(shù)據(jù)分析，對(duì)于甘草素來(lái)說(shuō)，C7位酚羥基鍵長(zhǎng)大于C4′位酚羥基的鍵長(zhǎng)，可知C7位可能是最大活性位點(diǎn)。而甘草苷則是在甘草素的C4′位發(fā)生了糖基化，只有一個(gè)C7位的酚羥基。對(duì)于異甘草素來(lái)說(shuō)，酚羥基的鍵長(zhǎng)由小到大順序?yàn)椋?9—OH、 ?4'—OH 、7—OH，預(yù)測(cè)C7位是可能的最大活性位點(diǎn)，更容易清除自由基。而異甘草苷是在異甘草素的C4′位發(fā)生了糖基化，2個(gè)酚羥基的鍵長(zhǎng)順序?yàn)?—OH鍵長(zhǎng)小于7—OH鍵長(zhǎng)。由以上分析可知，4種化合物的C7位均為最大活性位點(diǎn)，因此從 ? ? ?C7—OH的鍵長(zhǎng)判斷化合物的抗氧化能力由大到小的順序?yàn)楫惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷?/p>

2.2 ?NBO（Natural Bond Orbital） 電荷分析

親電基團(tuán)容易進(jìn)攻帶負(fù)電荷多的原子，親核基團(tuán)容易進(jìn)攻帶正電荷多的原子。人體內(nèi)的自由基主要為帶負(fù)電荷的氧自由基，所以酚羥基H原子就成為抗氧化反應(yīng)中的活性位點(diǎn)，酚羥基H所帶的正電荷越大，與氧自由基的相互吸引作用越強(qiáng)，化合物的抗氧化活性越強(qiáng)。計(jì)算所得的酚羥基H原子的NBO電荷列于表2。

由表2數(shù)據(jù)可看出4種化合物C7位羥基氫上所帶電荷都稍偏大，所以判斷C7位是自由基反應(yīng)的最大可能活性位點(diǎn)。4種化合物C7位羥基H所帶的正電荷由大到小順序?yàn)楫惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，由此推測(cè)抗氧化活性由大到小順序?yàn)椋寒惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，與前面的鍵長(zhǎng)分析結(jié)果一致。

2.3 ?酚羥基的鍵解離焓和電離勢(shì)分析

抗氧化劑的抗氧化機(jī)理可以根據(jù)化合物酚羥基的鍵解離焓（BDE）和電離勢(shì)（IP）來(lái)進(jìn)行分析。抽氫反應(yīng)機(jī)理是由最低的BDE值決定，單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)機(jī)理是由最低的IP值決定。為此，分別在B3LYP/6-31+G**水平上計(jì)算了BDE和IP值。模擬水提和醇提對(duì)化合物抗氧化活性的影響[9-11]，表3列出了不同溶劑中的BDE，表4列出了IP值。

為了考察4種黃酮化合物中各個(gè)位置酚羥基的抗氧化能力，分別對(duì)每個(gè)位置的酚羥基失去H后的自由基進(jìn)行計(jì)算，通過(guò)比較各個(gè)位置的BDE值，來(lái)判斷化合物的最大反應(yīng)活性位點(diǎn)。而張?chǎng)蝃15]等只對(duì)失去C7位酚羥基H后的自由基進(jìn)行了計(jì)算。由表3中4種化合物的BDE值可見(jiàn)，對(duì)于甘草素來(lái)說(shuō)，不管是在氣相中還是在溶液中，7—OH的BDE值都是最低的，這就表明C7—OH是最大反應(yīng)活性位點(diǎn);分析異甘草素和異甘草苷的BDE值可知， ? ?C7—OH的BDE值也是最低的;這些結(jié)果與前面的鍵長(zhǎng)和電荷分析結(jié)果一致。在氣相和溶劑中，4種化合物的BDE值由大到小順序?yàn)椋焊什蒈?、甘草素、異甘草苷、異甘草素，這就表明其抗氧化活性由大到小順序應(yīng)該為：異甘草素、異甘草苷、甘草素、甘草苷。對(duì)于甘草素和異甘草素來(lái)說(shuō)，C4′—OH的BDE值略高于C7—OH，說(shuō)明C4'—OH對(duì)化合物的抗氧化活性有貢獻(xiàn)，這可能也是導(dǎo)致成苷后抗氧化活性降低的原因之一。

考查溶劑效應(yīng)對(duì)抗氧化機(jī)理的影響，由表3可見(jiàn)，隨著溶劑極性的增加，BDE值增大，化合物抗氧化活性減弱，說(shuō)明溶劑的極性會(huì)影響抗氧化劑的抗氧化機(jī)理。LITWINIENKO[19]等研究苯酚與自由基在各種溶劑中的反應(yīng)機(jī)理發(fā)現(xiàn)，抗氧化機(jī)理與溶劑的體積、介電常數(shù)和溶劑化能力有關(guān)。他們指出在介電常數(shù)小的溶劑中，抽氫反應(yīng)機(jī)理是主要的。因此，可以得出在非極性溶劑中，4種甘草黃酮類(lèi)化合物的抗氧化機(jī)理以抽氫反應(yīng)機(jī)理為主。

由表4中數(shù)據(jù)可知，在氣相中甘草苷的電離勢(shì)IP值最大，為205.96 kcal·mol-1，異甘草素的電離勢(shì)IP值最小，為162.39 kcal·mol-1。在溶劑中4種化合物的IP值由小到大順序?yàn)椋寒惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，由IP值判斷的抗氧化活性由大到小順序亦為：異甘草素、異甘草苷、甘草素、甘草苷，與BDE的分析結(jié)果一致。由此可知，不管是BDE的分析還是IP分析，4種化合物的抗氧化活性由大到小順序?yàn)椋寒惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，?jì)算所得的結(jié)論與崔譽(yù)蓉[7]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及張?chǎng)蝃14]等在氣相中的計(jì)算結(jié)果一致。

另外，通過(guò)IP值的分析可以看出，在溶劑中，隨著溶劑極性的增加，IP值依次降低，化合物的抗氧化活性增強(qiáng)，說(shuō)明極性溶劑有利于單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。IP值與分子的供電子能力有著直接的關(guān)系，而極性溶劑有利于電子的離域，單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)更容易進(jìn)行[13-14]。這一結(jié)論與LITWINIENKO[19]等得出的溶劑對(duì)抗氧化機(jī)理影響的結(jié)論一致，他們指出在介電常數(shù)高的溶劑中，例如在水、甲醇和乙醇中，抗氧化劑以單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為主。

2.4 ?前線分子軌道能級(jí)分析

根據(jù)前線分子軌道理論，最高占據(jù)軌道（HOMO）和最低空軌道（LUMO）對(duì)分子活性的影響非比尋常。最高占據(jù)軌道HOMO所反映的是分子給出電子的能力，HOMO軌道能量值越大，該軌道上的電子就越活潑，越容易被激發(fā)，反應(yīng)就越容易進(jìn)行;LUMO軌道能量值越低，則該軌道越容易接受電 ?子[19]。HOMO能級(jí)相對(duì)越高，HOMO和LUMO之間的能級(jí)差（?E）值越小，化學(xué)反應(yīng)就越容易發(fā)生，化合物的活性就越強(qiáng)。4種化合物在氣相和溶劑中?E的列于表5。

根據(jù)表5中的數(shù)據(jù)分析，不管是在氣相還是在溶劑中，異甘草素的能級(jí)差ΔE最低，說(shuō)明異甘草素的抗氧化活性最大，然后是異甘草苷、甘草素，能級(jí)差最大的是甘草苷。所以根據(jù)前線分子軌道理論可判斷，4種甘草黃酮類(lèi)成分的抗氧化活性由大到小順序?yàn)椋寒惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷，這個(gè)結(jié)果與BDE和IP的分析結(jié)果一致，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]吻合。從能級(jí)差分析可得出，溶劑極性增加，能級(jí)差減小，化合物的抗氧化活性增強(qiáng)。因此，在極性溶劑中化合物以單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為主，而在非極性溶劑中，則以抽氫反應(yīng)為主。

3 ?結(jié) 論

本文通過(guò)密度泛函理論（DFT），采用B3LYP/6-31+G**方法，對(duì)中藥甘草中的4種黃酮類(lèi)化合物甘草素、異甘草素、甘草苷和異甘草苷的分子結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系進(jìn)行了理論研究。在抽氫反應(yīng)機(jī)理中，根據(jù)4種化合物的BDE值分析，4種化合物在氣相中的抗氧化活性由大到小順序?yàn)椋寒惛什菟?、異甘草苷、甘草素、甘草苷。而本文通過(guò)比較C4′—和C7—位酚羥基的BDE值，確定 ? C4'—OH對(duì)化合物的抗氧化活性有貢獻(xiàn)，但是 ? ?C7—位酚羥基仍然是最大活性位點(diǎn)。另外，本文還考察了單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)機(jī)理，通過(guò)IP值分析得出的抗氧化活性由大到小順序也為：異甘草素、異甘草苷、甘草素、甘草苷，進(jìn)一步說(shuō)明異甘草素的抗氧化活性是最高的。同時(shí)為了模擬真實(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，以水、甲醇和乙醇為溶劑，考察溶劑效應(yīng)對(duì)化合物抗氧化活性的影響，得出在抽氫反應(yīng)中，隨著溶劑極性的增加，抗氧化活性減弱;而在單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，隨著溶劑極性的增加，抗氧化活性增強(qiáng)，與之前的研究結(jié)論是一致的[13]。因此，在極性溶劑中化合物以單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為主，而在非極性溶劑中，則以抽氫反應(yīng)為主。

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