煙霧暴露大鼠肺血管形態(tài)與壓力變化的實(shí)驗(yàn)研究

邢愛萍 胡曉蕓 武曉蘭

1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，太原030001；2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，太原030001；3太原市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，太原030002

肺動(dòng)脈高壓是多種原因引起的嚴(yán)重的慢性肺循環(huán)疾病，肺血管重塑是肺動(dòng)脈高壓形成的重要病理基礎(chǔ)。吸煙是支氣管、肺疾病的主要危險(xiǎn)因素[1]。目前，吸煙對(duì)肺血管的直接作用引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。有研究表明，香煙煙霧可以直接作用于肺血管系統(tǒng)，導(dǎo)致肺血管重塑，進(jìn)而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓[2]。但其機(jī)制目前尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立煙霧暴露大鼠模型，觀察肺血管形態(tài)及壓力變化，并使用透射電鏡觀察肺小動(dòng)脈的超微結(jié)構(gòu)，探討吸煙對(duì)肺血管損害的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用卷煙為上海卷煙廠產(chǎn)大前門牌卷煙，每支含焦油13 mg，煙堿1.0 mg，一氧化碳14 mg。小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 清潔級(jí)雄性SD 大鼠40只，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(200±30)g，隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照(C)組、煙霧暴露1 個(gè)月 (S1m)組、煙霧暴露2 個(gè)月(S2m)組、煙霧暴露3個(gè)月 (S3m)組，每組10只，所有大鼠均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)和處理，于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。參照文獻(xiàn)[3]的方法制作大鼠實(shí)驗(yàn)性煙霧暴露裝置，以有機(jī)玻璃、不銹鋼絲及角鋼、玻璃板、空氣泵、壓力表、膠皮管等制成體積為1 m×0.6 m×0.5 m 的熏箱，并連接體積為0.3 m×0.2 m×0.25 m的吸煙小室。煙霧暴露時(shí)將大鼠放入玻璃熏箱內(nèi)，點(diǎn)燃的香煙煙霧由吸煙小室導(dǎo)入，熏煙時(shí)艙內(nèi)氧濃度保持在21%。大鼠每周熏煙6 d，每天上、下午各1 次，每次15 支，每支香煙點(diǎn)燃15 min后換煙。每次點(diǎn)燃2支香煙放入，對(duì)照組大鼠不予熏煙。本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2.2 平均右心室收縮壓 (mean right ventricular systolic pressure，mRVSP)測(cè)定 各組大鼠于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別為：S1m 組、S2m 組、S3m組以25%的烏拉坦 (4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于解剖臺(tái)，切開右頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及肌層，暴露右頸外靜脈，右頸外靜脈斜切口，將與壓力感受器連接并充滿肝素鹽水的PV-1肺動(dòng)脈插管插入右頸外靜脈，通過壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連。插入時(shí)保持導(dǎo)管的弧形向下，當(dāng)插管插入3～4 cm 時(shí)，將插管左旋并向前推進(jìn)，并密切觀察生理記錄儀圖形。當(dāng)壓力上升并出現(xiàn)右心室波形時(shí)，立即固定導(dǎo)管并描記該波形，則測(cè)得m RVSP。

1.2.3 動(dòng)脈血?dú)夥治?測(cè)壓完畢后，腹主動(dòng)脈采血2 ml，2 h內(nèi)采用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x行PaO2測(cè)定。

1.2.4 透射電鏡標(biāo)本制備 取新鮮肺組織(1 mm×1 mm×1 mm)立即固定于預(yù)冷的3%戊二醛溶液，再用1%鋨酸后固定，梯度脫水后用環(huán)氧樹脂861包埋。半薄切片定位肺腺泡內(nèi)肌型動(dòng)脈后，再行超薄切片，用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色后在JEM-100CXⅡ型透射電鏡下觀察肺腺泡內(nèi)肌型動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，彈性纖維及平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察和圖像分析 石蠟切片常規(guī)做HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行肺小動(dòng)脈管壁面積/管總面積 (wall area，WA%)的測(cè)量。選取直徑為100～200μm 的5支肺小動(dòng)脈測(cè)量并記錄WA%。

1.2.6 α-SMA 免疫組織化學(xué)染色 采用鏈酶親和素-過氧化物酶法，一抗為小鼠α-SMA 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，1∶100)。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波修復(fù)抗原；用5%牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn)，依次滴加α-SMA、生物素化羊抗小鼠IgG、SABC 試劑，3,3,-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)有棕黃色顆狀著色。隨機(jī)選取5支肺小動(dòng)脈直徑100～200μm 的肺小動(dòng)脈，測(cè)量平滑肌細(xì)胞平均吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示，各組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)分析。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析法。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺小動(dòng)脈管腔正常，管壁及其周圍無炎性細(xì)胞浸潤。S2m 組和S3m 組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄，有不同程度的斷裂，肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，周圍均出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，以S3m 組為著。

2.2 煙霧暴露各組PaO2與m RVSP變化 C 組、S1m、S2m 及S3m 組PaO2分別為 (96.2±4.3)mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)、 (92.1±5.2)mm Hg、 (90.5±4.1)mm Hg、 (89.6±4.8)mm Hg，各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =2.004，P ＞0.05)，見表1。各組大鼠m RVSP 檢測(cè)結(jié)果分別為C 組 (14.07±4.18)mm Hg，S1m 組 (16.85±1.26)mm Hg，S2m 組(23.57 ± 4.51) mm Hg，S3m 組 (65.63 ±5.6)mm Hg，S3m 組大鼠mRVSP較C 組及S1m組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =10.100，P ＜0.01，表1)。

2.3 煙霧暴露各組肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察 C 組內(nèi)皮細(xì)胞扁平，小動(dòng)脈內(nèi)彈力膜規(guī)則，平滑肌細(xì)胞無扭曲變形，膠原纖維排列整齊。S1m 組肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，內(nèi)膜增厚，細(xì)胞內(nèi)可見線粒體腫脹，彈力纖維增生，平滑肌細(xì)胞輕度增生。S2m 組內(nèi)彈力膜厚薄不均，部分?jǐn)嗔?，結(jié)構(gòu)不清；平滑肌走向不規(guī)則，膠原纖維增生。S3m 組肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重變形，胞內(nèi)線粒體損傷明顯，腫脹、減少甚至消失，細(xì)胞器模糊不清。內(nèi)膜增厚更為明顯，膠原纖維大量增生(圖1)。

2.4 肺血管形態(tài)及WA%分析結(jié)果 C 組大鼠肺動(dòng)脈壁薄，煙霧暴露各組隨煙霧暴露時(shí)間延長，肺動(dòng)脈壁逐漸增厚。WA%呈時(shí)間依賴性增加，煙霧暴露各組WA%與C 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.01)；煙霧暴露各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F =251.690，P ＜0.01，表1，圖2)。

2.5 肺小動(dòng)脈α-SMA 的表達(dá) C組血管壁僅見少許α-SMA 表達(dá)，隨煙霧暴露時(shí)間延長，肺動(dòng)脈壁α-SMA 表達(dá)量呈時(shí)間依賴性增加，煙霧暴露各組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.100，P ＜0.01)；煙霧暴露各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.01，表1，圖3)。

2.6 相關(guān)分析Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示 肺血管WA%與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.703，P ＜0.05)；肺血管WA%與m RVSP 無相關(guān)性(r=0.379，P ＞0.05)。

表1 各組大鼠PaO2、m RVSP、α-SMA、WA%比較 (±s)

表1 各組大鼠PaO2、m RVSP、α-SMA、WA%比較 (±s)

注：1 mm Hg=0.133 k Pa；m RVSP 為平均右心室收縮壓；α-SMA 為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；WA%為管壁面積占血管總面積的百分比；與對(duì)照組比較，a P ＜0.01；與煙霧暴露1個(gè)月組比較，b P ＜0.01；與煙霧暴露2個(gè)月組比較，c P ＜0.05

組別鼠數(shù)PaO2 (mm Hg)m RVSP (mm Hg)α-SMA (A 值)WA% (%)對(duì)照組10 96.2±4.3 14.07±4.18 37.5±7.5 30.1±4.1煙霧暴露1個(gè)月組10 92.1±5.2 16.85±1.26 52.6±14.3a 41.2±6.3a煙霧暴露2個(gè)月組10 90.5±4.1 23.57±14.51 72.2±13.6ab 52.0±7.1ab煙霧暴露3個(gè)月組10 89.6±4.8 65.63±0.93ab 98.1±15.6abc 62.1±6.9abc F 值2.004 10.100 23.100 251.690 P 值＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

圖1 各組大鼠肺小血管電鏡觀察結(jié)果 A：對(duì)照組 ×15 000；B：煙霧暴露1個(gè)月組 ×12 000；C；煙霧暴露2個(gè)月組 ×12 000；D：煙霧暴露3個(gè)月組 ×12 000

圖2 各組大鼠肺動(dòng)脈HE染色結(jié)果 HE ×100 A：對(duì)照組；B：煙霧暴露1個(gè)月組；C；煙霧暴露2個(gè)月組；D：煙霧暴露3個(gè)月組

圖3 各組大鼠肺動(dòng)脈α-SMA 免疫組化結(jié)果 免疫組織化學(xué) ×400 A：對(duì)照組；B：煙霧暴露1個(gè)月組；C；煙霧暴露2個(gè)月組；D：煙霧暴露3個(gè)月組

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是一組由異源性疾病和不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床病理生理綜合征，臨床表現(xiàn)為右心室負(fù)荷增加，活動(dòng)耐力下降，嚴(yán)重者可發(fā)生心臟衰竭而死亡。肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。血管收縮、血管重塑和血栓形成是導(dǎo)致肺循環(huán)血管阻力增加的主要原因[4]。肺血管重塑是肺動(dòng)脈高壓的病理學(xué)基礎(chǔ)，其特點(diǎn)為內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌細(xì)胞增生和肥大，外膜成纖維細(xì)胞增殖和基質(zhì)蛋白合成[5]。長期煙霧暴露可以導(dǎo)致肺血管重塑，且早于肺氣腫的形成[6]。本研究在常氧下給予大鼠煙霧暴露，發(fā)現(xiàn)煙霧暴露3個(gè)月后右心室收縮壓明顯升高，而PaO2無下降，與Wright等[7]研究結(jié)果一致。反映了煙霧暴露所致肺動(dòng)脈高壓與低氧血癥無直接關(guān)系，分析可能是香煙煙霧直接作用于肺血管系統(tǒng)而致肺血管重塑。

吸煙是一種較為嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。香煙煙霧中含7 000多種化學(xué)物質(zhì)，主要有尼古丁、焦油、一氧化碳、丙烯醛、一氧化氮、氫氰酸等6種，香煙中的主要成分尼古丁及其代謝產(chǎn)物有刺激平滑肌細(xì)胞增殖的作用。缺氧不是肺動(dòng)脈高壓的唯一因素，吸煙、炎癥、氧化-抗氧化失衡等均可能參與肺動(dòng)脈高壓的形成[8]。本研究觀察不同煙霧暴露時(shí)間對(duì)大鼠肺血管形態(tài)的影響，結(jié)果表明，煙霧暴露各組反映肺血管重塑的客觀指標(biāo)WA%均高于C 組，且隨時(shí)間延長肺血管壁增厚漸明顯，提示吸煙可致肺血管壁增厚。吸煙所致肺血管壁增厚的機(jī)制復(fù)雜，涉及血管舒縮功能失調(diào)、平滑肌增殖凋亡異常及血管重塑等多個(gè)環(huán)節(jié)[9-10]。本研究還發(fā)現(xiàn)煙霧暴露各組α-SMA 表達(dá)均高于C 組，而以S3m 組更為明顯，提示吸煙導(dǎo)致無肌型動(dòng)脈肌化，而這可能是肺循環(huán)阻力增大、肺動(dòng)脈壓升高的關(guān)鍵。

吸煙對(duì)肺血管的直接損害研究較少，煙霧暴露所致肺小血管超微結(jié)構(gòu)病變尚屬研究的薄弱環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與C 組相比，煙霧暴露后肺小動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)彈力膜斷裂，基底膜不完整及不規(guī)則增厚，膠原纖維在內(nèi)膜下增生，中膜平滑肌細(xì)胞增生。與低氧研究結(jié)果類似但程度似有差別[11]，表明吸煙可引起肺血管重塑，使肺微循環(huán)發(fā)生障礙，增加肺血管阻力，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展。

總之，煙霧暴露可使肺血管形態(tài)發(fā)生明顯改變，肺小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致肺血管重塑，肺血流阻力增加，右心室收縮壓升高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突