新疆某牧場(chǎng)牛病毒性腹瀉的診斷及防控

王 標(biāo)，吳妍妍，陳紅莉，魏 勇，齊亞銀*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆天山軍墾牧業(yè)有限責(zé)任公司，新疆 石河子 832000；3.新疆天澳牧業(yè)有限公司 新疆 奎屯 833200)

牛病毒性腹瀉(BVD)又稱牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD),是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的一種以發(fā)熱、劇烈腹瀉、黏膜糜爛潰瘍、免疫抑制為主要特征的接觸性傳染病[1-2]。該病可引起仔畜先天性免疫缺陷、發(fā)育不良、存活率低等，還可引起妊娠母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等繁殖障礙性疾病，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴(yán)重的危害，同時(shí)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病呈世界性分布，廣泛存在于美國(guó)、英國(guó)等國(guó)家，在我國(guó)新疆、內(nèi)蒙、寧夏等20多個(gè)省市自治區(qū)均有該病的發(fā)生，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，該病時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3-5]。

2019年7月間，新疆某規(guī)?；翀?chǎng)陸續(xù)出現(xiàn)犢牛腹瀉、死亡的情況，發(fā)病犢牛在3月齡以內(nèi)，并且發(fā)病急，病死率高。本試驗(yàn)以現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷的方法，從發(fā)病原因、經(jīng)過、臨床癥狀、病理剖檢變化入手，同時(shí)無菌采集發(fā)病犢牛的腸內(nèi)容物、病死牛的臟器組織以及健康犢牛的腸內(nèi)容物等樣品，通過RT-PCR對(duì)BVDV 5’-UTR基因進(jìn)行檢測(cè)及序列分析，試驗(yàn)結(jié)果為本地區(qū)牛病毒性腹瀉-粘膜病的診斷、免疫防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在本次牧場(chǎng)犢牛發(fā)病期間無菌采集的4頭病死犢牛腸組織、38份發(fā)病犢牛腸內(nèi)容物、10份同群亞健康犢牛腸內(nèi)容物。

1.1.2 主要儀器及試劑 移液器、電動(dòng)組織研磨器購(gòu)自上海力辰科技有限公司；TC-512 PCR 儀購(gòu)自英國(guó) Bibby 科技有限公司；DYY-6B 電泳儀購(gòu)自雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司；電子天平購(gòu)自上海歡奧科技有限公司；離心機(jī)購(gòu)自SiGMA 離心機(jī)公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；總RNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程大連公司；引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查 2019年7月間，3次前往某大型牧場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查取樣，與管理人員溝通，了解犢牛發(fā)病史、發(fā)病年齡、發(fā)病特點(diǎn)、往年發(fā)病率和發(fā)病季節(jié)，檢查圈養(yǎng)犢牛情況，包括圈舍衛(wèi)生、環(huán)境清潔程度、空氣質(zhì)量、溫度、初乳投喂量、消毒、病犢隔離等情況，觀察感染犢牛的癥狀，包括感染犢牛的整體狀態(tài)、精神狀態(tài)、體溫、食欲和排便等情況，詢問治療情況和效果，并做好記錄，解剖病死犢牛，觀察內(nèi)臟病理情況，采集樣本。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 將采集的病料處理后，使用總RNA提取試劑盒提取病毒核酸，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后使用參照文獻(xiàn)[4]中BVDV 5’-UTR引物(詳表1)進(jìn)行PCR和瓊脂凝膠電泳試驗(yàn)以及目的條帶的回收和測(cè)序，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件詳見表2, PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序詳見表3。

表1 試驗(yàn)中BVDV 5’-UTR基因的引物序列

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件

表3 PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

1.2.3 序列測(cè)定與分析 將從兩頭死亡犢牛腸組織中提取的核酸經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后的陽(yáng)性產(chǎn)物切膠回收，然后與PMD19-T載體16 ℃連接過夜，使用E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再涂布于含有AMP的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，最后將這2份陽(yáng)性樣品送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用DNAStar軟件分析測(cè)序結(jié)果，與GenBank中登錄的8株BVDV-1型、4株BVDV-2型參考株(表4)進(jìn)行序列比對(duì)和同源性比較，并使用MEGA軟件構(gòu)建BVDV5’-UTR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

本次疾病發(fā)生于炎熱的夏季，發(fā)病犢牛年齡集中在3月齡以內(nèi)，存在水平傳播和垂直傳播兩種方式，潛伏期2～14 d不等。在調(diào)查期間該牧場(chǎng)共有

142頭犢牛，發(fā)病率為39.43%(56/142)，死亡18頭，病死率為32.14%(18/56)；犢牛圈舍整體環(huán)境較差，糞便未能及時(shí)清理，未安裝換氣扇，導(dǎo)致空氣不流通，氨氣味較重，沒有降溫設(shè)備，圈舍整體溫度較高。飼養(yǎng)管理人員防范意識(shí)淡薄，僅使用石灰對(duì)地面進(jìn)行消毒，未對(duì)周圍環(huán)境進(jìn)行消毒，發(fā)病犢牛仍與其他健康犢牛同群飼喂，未進(jìn)行嚴(yán)格隔離。查閱資料表明，該牧場(chǎng)往年同季節(jié)也曾發(fā)生過本病。

發(fā)病犢牛主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退或廢絕、反芻停止、被毛粗亂無光澤、體溫升高至39.8～41.5 ℃之間、嚴(yán)重腹瀉、部分糞便中帶有血液和腸黏膜碎片、部分病牛表現(xiàn)有神經(jīng)癥狀和呼吸困難。病理解剖可見病死牛嚴(yán)重脫水、腸道有大量出血點(diǎn)、腸黏膜有出血點(diǎn)、腸壁菲薄、胃腸道內(nèi)容物有大量氣泡、腸系膜淋巴結(jié)腫大、心臟表面充血、少量出血點(diǎn)、心包內(nèi)有大量積液，打開顱腔可見腦組織腫脹有出血點(diǎn)、顱腔內(nèi)有積液,詳見圖1。

注:1.血樣糞便；2.腸道廣泛性出血；3.腸黏膜出血；4.胃腸內(nèi)容物有大量氣泡；5.腸系膜淋巴結(jié)腫大出血；6.心臟表面充血出血

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

將采集的病料樣品經(jīng)過RT-PCR檢測(cè)，可以擴(kuò)增得到293 bp大小的目的基因，確定該病病原為BVDV，其中死亡犢牛腸組織核酸提取樣陽(yáng)性率為100.00%(4/4)，發(fā)病犢牛腸內(nèi)容物提取樣核酸陽(yáng)性率為94.74%(36/38)，同群亞健康犢牛腸內(nèi)容物提取樣核酸陽(yáng)性率為30.00%(3/10)，結(jié)果詳見圖2。

注:M為DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 1000; 0為陽(yáng)性對(duì)照1～2為死亡犢牛組織提取樣;3～5為發(fā)病犢牛糞便提取樣;6為亞健康犢牛糞便提取樣;7為陰性對(duì)照。

2.3 遺傳進(jìn)化分析

此次共送檢測(cè)序兩份RT-PCR陽(yáng)性樣品，將這兩份陽(yáng)性樣品的測(cè)序結(jié)果使用DNAStar Meggalign軟件與部分BVDV參考株進(jìn)行序列對(duì)比(圖3)。此次測(cè)序的2份陽(yáng)性樣品的同源性為99.0%，XJB19-01株、XJB19-02株均與參考BJ-2013的同源性最高，分別為97.9%、98.4%，屬于BVDV-1a型。使用MEGA軟件將測(cè)序的兩株BVDV基因與部分參考株做系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)表明，相比于其他參考株，XJB19-01和XJB19-02與參考株BJ-2013處于同一進(jìn)化分支，三者親緣關(guān)系最近。

圖3 檢測(cè)陽(yáng)性基因與GeneBank上參考株同源性比較

圖4 BVDV 5’-UTR 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的疾病也隨之而來，嚴(yán)重困擾并影響著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。牛病毒性腹瀉-粘膜病目前在世界各地均有發(fā)病的報(bào)道，該病自20世紀(jì)40年代在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來[6]，便在世界范圍內(nèi)廣泛流行和傳播。目前為止在我國(guó)新疆等20多個(gè)省市自治區(qū)都有發(fā)病，表明該病具有很強(qiáng)的傳染性，同時(shí)牛群感染BVDV已經(jīng)是很普遍的現(xiàn)象[7-8]。

本次試驗(yàn)采用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相結(jié)合的方法進(jìn)行診斷，具有較高的準(zhǔn)確性。通過對(duì)發(fā)病犢牛的年齡、臨床癥狀、病理剖檢情況及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該牧場(chǎng)發(fā)病感染牛群呈現(xiàn)低齡化，引起的病變典型，病死率高，存在較多的隱性感染牛，增大了防控難度。

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，隔離淘汰病牛，嚴(yán)格按照消毒程序?qū)θι徇M(jìn)行徹底消毒，改善飼養(yǎng)環(huán)境，降低炎熱的天氣對(duì)犢牛造成的應(yīng)激反應(yīng)，提高犢牛的舒適感。健康牛群使用BVD-IBR二聯(lián)疫苗(哞樂優(yōu))免疫。在免疫前14 d、免疫后21 d采用ELISA的方法對(duì)隨機(jī)選取的21頭健康犢牛的血清進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為61.90%(13/21)、90.48%(19/21)，免疫后抗體水平相比于免疫前得到了顯著的提升，經(jīng)上述方法的綜合防控，該牧場(chǎng)已經(jīng)有效的控制了本病的進(jìn)一步發(fā)生。由此也進(jìn)一步表明牛群整體抗體陽(yáng)性率達(dá)到較高水平時(shí)可以避免疾病在牛群內(nèi)傳播，同時(shí)疫苗免疫也是防控疾非常有效的方法之一。

關(guān)于本病的防控，全世界養(yǎng)牛國(guó)家主要有兩種做法，一是歐洲各國(guó)目前采取的是檢疫、淘汰的方法，取得了較好的效果，但也存在投資大、耗時(shí)長(zhǎng)等問題；二是美國(guó)等部分地區(qū)的做法，采用檢疫結(jié)合免疫的方式，效果較好[9-10]。結(jié)合我國(guó)畜牧業(yè)國(guó)情及本次試驗(yàn)結(jié)果，建議首先對(duì)牛群進(jìn)行檢疫，篩選并淘汰PI牛，從根本上消滅傳染源；其次制定嚴(yán)格全面生物安全防控，加強(qiáng)消毒，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善牛群生長(zhǎng)環(huán)境，減少應(yīng)激，提高牛群抗病力；同時(shí)采用BVD-IBR二聯(lián)疫苗全群免疫，科學(xué)規(guī)范免疫程序，定期抗體檢測(cè)，通過科學(xué)的免疫防控控制該病的發(fā)生。