超高壓處理對苦杏仁分離蛋白結(jié)構(gòu)和致敏性的影響

朱乾乾， 陳靜靜， 張 濤， 江 波*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué)，食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

食物過敏是由于進(jìn)食含有過敏原的食物引起的免疫反應(yīng)。癥狀主要包括皮膚瘙癢、咳嗽、惡心、嘔吐等。引起食物過敏的食品主要包括奶類、禽蛋類、魚類、甲殼類、花生、大豆、堅(jiān)果類和小麥[1]。預(yù)防食物過敏的最好方式就是完全避免接觸過敏食物。與此同時(shí)，越來越多的研究人員致力于通過食品加工過程來消除或減少食物中的過敏原。大部分過敏原是蛋白質(zhì)，加工處理會掩蓋或展開引起過敏的抗原表位，從而降低或提高對抗原的識別，進(jìn)而改變過敏性食物的致敏性。迄今為止，用于消除食物致敏原的加工技術(shù)有熱處理、美拉德反應(yīng)、發(fā)酵、輻射、酶法水解和超高壓技術(shù)[2]。超高壓技術(shù)是一種替代性食品保存技術(shù)，具有保留食品感官和營養(yǎng)品質(zhì)的特性。通過高壓使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破裂或形成非共價(jià)鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，也可以誘導(dǎo)形成新的二硫鍵來穩(wěn)定變性蛋白或使蛋白質(zhì)聚集[3]。近年來，利用超高壓技術(shù)降低或消除食品致敏性的報(bào)道較多，例如利用超高壓技術(shù)來降低牛奶、大豆、花生等食品的致敏性[4]。

苦杏仁是一種富含必需脂肪酸、蛋白質(zhì)、膳食纖維和其他功能性成分的堅(jiān)果，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%～50%，蛋白質(zhì)23.6%～26.2%，苦杏仁苷約為3%[5]。據(jù)報(bào)道，苦杏仁在我國新疆、河北和山東等地種植面積廣，資源豐富，2016年產(chǎn)量達(dá)2.6×106噸。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦杏仁具有止咳、祛痰的功效[6]。杏仁乳是由杏仁和水均質(zhì)獲得的膠體分散體系，近年來，杏仁乳被作為乳糖不耐癥人群的替代乳品，在市場上廣受歡迎。但苦杏仁含有和美國大杏仁almond相同的過敏原成分amandin[7]。二維電泳結(jié)果顯示，美國大杏仁almond種子含有188種不同的蛋白質(zhì)[8]。據(jù)世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)盟過敏原命名小組委員會報(bào)道，美國大杏仁almond中含有5種 過 敏 原，命 名 為Prudu 3、Prudu 4、Prudu 5、Prudu 6和Prudu 8。Prudu 6是11S類大豆球蛋白，相對分子質(zhì)量約為3.6×105，被稱為amandin，是美國大杏仁almond最主要的過敏原成分。

國外關(guān)于美國大杏仁almond過敏性的研究，主要有熱加工、輻射和超高壓處理。輻射處理不能改變almond杏仁蛋白結(jié)構(gòu)及其致敏性，輻射處理和高壓滅菌，也不能明顯地改變almond杏仁蛋白的結(jié)構(gòu)和致敏性[9]。almond杏仁過敏原熱穩(wěn)定性好，且不受輻射處理的影響。Li等人通過多克隆抗體的ELISA實(shí)驗(yàn)證明，超高壓處理對almond杏仁致敏性沒有影響，但Santosh Dhakal等人通過amandin的4C10（構(gòu)型表位）和4F10（線性表位）表位分別制備的抗體，證實(shí)超高壓能夠降低美國大杏仁almond的致敏性。在450、600 MPa，30℃處理600 s，4C10相關(guān)表位的免疫反應(yīng)性低于5%，4F10相關(guān)表位的免疫反應(yīng)性大約為50%[10]。而關(guān)于超高壓處理對苦杏仁分離蛋白結(jié)構(gòu)和整體致敏性影響等方面的研究比較少。作者研究不同超高壓強(qiáng)度處理對苦杏仁分離蛋白分離物結(jié)構(gòu)和致敏性的影響，以期為超高壓處理在食品致敏性方面的應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁種子：市售；丙烯酰胺、N-N-亞甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；福林酚、8-苯胺-1-萘磺酸銨鹽：美國Sigma-Aldrich產(chǎn)品；杏仁過敏原ELISA試劑盒：德國Pribolab公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

超高壓設(shè)備：包頭九久科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)：島津（上海）有限公司產(chǎn)品；圓二色譜：英國應(yīng)用物理公司產(chǎn)品；F-7000熒光分析儀：日本日立公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦杏仁分離蛋白的制備

1）脫脂：將苦杏仁浸泡20 h，去皮，40℃真空干燥10 h。研磨成粉末，以1 g∶10 mL的比例加入丙酮，磁力攪拌2 h進(jìn)行脫脂，重復(fù)3次。在通風(fēng)櫥中過夜蒸發(fā)剩余丙酮，研磨均勻。

2）苦杏仁分離蛋白的提?。阂? g∶10 mL的比例加入pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液，4℃磁力攪拌2 h，重復(fù)兩次，提取粉末中的苦杏仁分離蛋白分離物。8 000g離心20 min，取上清液，過0.45μm纖維素膜[11]。

1.3.2 苦杏仁分離蛋白質(zhì)量濃度測定 通過福林酚法測定提取液中苦杏仁分離蛋白的質(zhì)量濃度[12]。取1 mL分離蛋白溶液，與5 mL溶液A和溶液B的混合液（體積比1∶1）反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL的福林酚溶液反應(yīng)30 min，在650 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白為標(biāo)樣制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.99。用pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液將其稀釋為2 mg/mL，為后面的實(shí)驗(yàn)定量。

1）溶液A：準(zhǔn)確稱取10 g碳酸鈉，2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中。

2）溶液B：準(zhǔn)確稱取0.25 g五水合硫酸銅溶解于50 mL去離子水中。

1.3.3 超高壓處理 取5 mL溶液置于超高壓設(shè)備腔體中，自動(dòng)升壓至所需壓力。加壓結(jié)束后，瞬間降壓，取出樣品，立即放入冰中保存。在100～500 MPa下處理900 s，研究不同強(qiáng)度的高壓處理對苦杏仁分離蛋白的影響。在500 MPa下處理0～900 s，研究不同加工時(shí)間對苦杏仁分離蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響。加壓處理在常溫（25℃）條件下進(jìn)行。

1.3.4 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜的測定 將處理前后的苦杏仁分離蛋白溶液樣品稀釋為0.05 mg/mL，將溶液置于1 mm的石英比色皿中，樣品的掃描波長范圍195～260 nm，掃描3次取平均值，步進(jìn)分辨率為1 nm，采集時(shí)間為1 s，帶寬為1 nm，需扣除蛋白溶解緩沖液的背景。在計(jì)算中假設(shè)氨基酸殘基均值為900，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示，二級結(jié)構(gòu)組成通過系統(tǒng)自帶的CDMN軟件分析。

1.3.5 外源熒光光譜的測定 將處理前后的苦杏仁分離蛋白溶液樣品稀釋成0.20 mg/mL，取20μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的樣品溶液中，混合均勻，立即在激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為500～850 nm，狹縫為2.5 nm條件下掃描其熒光光譜[13]。

1.3.6 表面疏水性指數(shù)（H0）測定 將苦杏仁樣品稀釋成0.005～0.20 mg/mL的溶液[14]。然后將20 μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的樣品液中，混合均勻，立即在激發(fā)波長550 nm，發(fā)射波長549 nm，狹縫為2.5 nm的條件下測定其熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度相對于蛋白質(zhì)量濃度的初始斜率，被定義為蛋白表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.7 SDS-PAGE采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對超高壓處理前后的苦杏仁分離蛋白組分進(jìn)行分析[6]。電泳分離膠質(zhì)量濃度為12 g/dL，濃縮膠質(zhì)量濃度為4 g/dL。將樣品與緩沖液以體積比1∶4混合，沸水浴煮沸10 min后上樣，電壓為120 V。電泳完畢，采用考馬斯亮藍(lán)染色液G-250染色2 h，過夜脫色后進(jìn)行凝膠成像。

1.3.8 苦杏仁分離蛋白致敏性的測定 處理前后樣品的致敏性通過杏仁過敏原ELISA試劑盒進(jìn)行檢測[15]。取100μL上清液加到96孔酶標(biāo)板，室溫下孵育20 min。然后每孔加入300μL洗滌緩沖液清洗3次，用力甩干。每孔加入100μL培養(yǎng)物（苦杏仁過氧化物酶）到每孔中，室溫下培育20 min，如前洗滌3次。每孔加入100μL培養(yǎng)基溶液，室溫下允許暗處反應(yīng)20 min。每孔添加100μL停止液（0.5 mol/L H2SO4）終止酶反應(yīng)。測定其在450 nm波長處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

超高壓處理苦杏仁分離蛋白的圓二色譜圖如圖1所示?？嘈尤史蛛x蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲組成。208 nm和222 nm處出現(xiàn)負(fù)峰，表明α-螺旋的存在；218 nm處出現(xiàn)寬的負(fù)峰，表明β-折疊的存在。圓二色譜圖顯示，隨著超高壓處理強(qiáng)度逐漸增加，處理前后苦杏仁分離蛋白樣品的負(fù)峰對應(yīng)波長維持不變，負(fù)峰強(qiáng)度基本沒有發(fā)生變化，表明α-螺旋和β-折疊的含量不變。通過CDMN軟件分析組分含量，與圖譜顯示信息一致。研究結(jié)果顯示，超高壓處理不影響蛋白樣品的二級結(jié)構(gòu)，該處理方法對苦杏仁分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成所引起的致敏性沒有顯著影響。

圖1 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白圓二色譜圖的影響Fig.1 CD results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to different pressure treatments under the same processing time

2.2 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

圖2 描述了不同強(qiáng)度超高壓處理以及500 MPa處理不同時(shí)間對應(yīng)的苦杏仁分離蛋白熒光光譜圖。由圖可知，當(dāng)超高壓處理的時(shí)間固定為900 s時(shí)，隨著壓強(qiáng)的增加，苦杏仁分離蛋白在波長為500～850 nm的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度增加，壓強(qiáng)達(dá)到500 MPa時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增加，表明苦杏仁分離蛋白的疏水區(qū)域增加。另外，當(dāng)壓強(qiáng)固定為500 MPa時(shí)，隨著加壓時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加。在較高壓強(qiáng)與較長時(shí)間的條件下，超高壓處理可能導(dǎo)致疏水性基團(tuán)的暴露，改變苦杏仁分離蛋白的三級結(jié)構(gòu)，影響苦杏仁分離蛋白的構(gòu)型表位，進(jìn)一步降低或增加苦杏仁分離蛋白致敏性。

2.3 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白表面疏水性的影響

為進(jìn)一步研究超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響，證明熒光強(qiáng)度的增加是由于疏水性基團(tuán)暴露所引起的，作者研究了不同壓強(qiáng)、時(shí)間處理后苦杏仁分離蛋白的表面疏水性變化，結(jié)果如圖3所示。表面疏水性通常被用作蛋白構(gòu)象改變的探針。100～400 MPa處理900 s時(shí)，苦杏仁分離蛋白的表面疏水性沒有發(fā)生明顯變化，當(dāng)壓強(qiáng)達(dá)到500 MPa時(shí)，表面疏水性顯著增加。在500 MPa的強(qiáng)度下處理不同時(shí)間，隨著加壓時(shí)間的增大，表面疏水性逐漸增大。表面疏水性的變化趨勢表明超高壓處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的展開，使內(nèi)部疏水區(qū)域暴露，從而增強(qiáng)了表面疏水性強(qiáng)度。

圖2 不同壓強(qiáng)處理900 s和500 MPa處理不同時(shí)間對苦杏仁分離蛋白熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescence spectroscopy results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

圖3 不同壓強(qiáng)處理900 s和500 MPa處理不同時(shí)間對苦杏仁分離蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Surface hydrophobicity results of bitterapricot kernelproteinisolate that were subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

2.4 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白SDS-PAGE的影響

在非還原電泳中，苦杏仁主要蛋白amandin主要由相對分子質(zhì)量為61 000和63 000的多肽組成。每個(gè)多肽都由一個(gè)酸性亞基（42 000～46 000）和一個(gè)堿性亞基（20 000～22 000）組成，亞基之間通過二硫鍵相連[19]。在存在還原劑的條件下，amandin的SDS-PAGE圖顯示相對分子質(zhì)量為44 000、42 000、28 000的條帶或41 000、39 000、22 000和21 000大小的條帶。超高壓處理前后杏仁蛋白的SDSPAGE結(jié)果如圖4所示，未處理杏仁蛋白（通道0）的泳道中可以清晰地看到61 000、63 000、41 000和39 000的多肽條帶，在100～400 MPa處理900 s時(shí)，苦杏仁分離蛋白的條帶沒有發(fā)生明顯變化；當(dāng)超高壓的強(qiáng)度為500 MPa，處理900 s時(shí)，伴隨有大相對分子質(zhì)量條帶的減弱，以及小相對分子質(zhì)量條帶的形成。SDS-PAGE圖也顯示500 MPa處理0～300 s時(shí)，多肽條帶不會改變；當(dāng)處理600、900 s時(shí)，61 000和63 000的條帶強(qiáng)度減弱，伴隨有約45 000大小的條帶生成，可能是由于苦杏仁分離蛋白的不完全裂解造成的。結(jié)果與Sathe等人結(jié)果一致，他們認(rèn)為在450～600 MPa壓力強(qiáng)度處理時(shí)，杏仁蛋白amandin相對分子質(zhì)量為61 000和63 000的條帶逐漸減弱，伴隨著20 000和40 000條帶的生成[10]。超高壓處理可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致二硫鍵的斷裂或重組。

圖4 不同壓強(qiáng)處理900 s和500 MPa壓力下處理不同時(shí)間對苦杏仁分離蛋白SDS-PAGE的影響Fig.4 SDS-PAGE results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

2.5 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白致敏性的影響

圖5 顯示超高壓處理后苦杏仁分離蛋白的免疫反應(yīng)性發(fā)生了變化，100～500 MPa處理900 s后，苦杏仁分離蛋白的致敏性逐漸降低。在500 MPa處理900 s的條件下，苦杏仁分離蛋白的致敏性可以降低到25.69%，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用此壓力強(qiáng)度。由圖可知，500 MPa處理0～900 s，杏仁蛋白的免疫反應(yīng)性顯著下降，900 s時(shí)免疫反應(yīng)性的下降最為顯著?？嘈尤史蛛x蛋白經(jīng)超高壓處理后致敏性的下降，可能是由于超高壓處理引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化引起的。Li等認(rèn)為超高壓處理能夠引起大豆蛋白結(jié)構(gòu)的伸展與變性，也能引起蛋白質(zhì)的解聚或聚合[17]。

圖5 不同壓強(qiáng)處理900 s和500 MPa處理不同時(shí)間對苦杏仁分離蛋白免疫反應(yīng)性的影響Fig.5 ELISA results of allergens in bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

3 結(jié)語

超高壓處理在降低食品的免疫反應(yīng)性方面提供了潛在的能力，此處理方式對食品質(zhì)量和營養(yǎng)特性不會產(chǎn)生不利影響。圓二色譜和熒光光譜結(jié)果表明，超高壓處理不能顯著改變苦杏仁分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，但可以通過疏水性基團(tuán)的暴露，增加杏仁蛋白質(zhì)的表面疏水性，使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)展開，增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度。超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變，可能破壞其構(gòu)象表位，引起苦杏仁致敏性的變化。ELISA結(jié)果表明，500 MPa處理900 s，苦杏仁分離蛋白的免疫反應(yīng)性可以降低至25.69%?？偟膩碚f，這項(xiàng)研究表明超高壓技術(shù)可以作為降低食品致敏性的新型食品加工技術(shù)，用于改善苦杏仁產(chǎn)品的質(zhì)量，增加其潛在的應(yīng)用價(jià)值。