光磁雙模態(tài)探針釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物合成方法的改進(jìn)

盛 薈，梁 磊，周童亮，賈彥興，王 彤，袁 蘭，韓鴻賓

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京 100191； 2. 北京大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心，北京 100191； 3. 北京市磁共振成像設(shè)備與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191； 4. 北京大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，北京 100191； 5. 北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科，北京 100191)

磁共振成像是一種非常有潛力的組織成像方法，能夠?qū)崿F(xiàn)在體觀察組織深部的特征。本課題組以往的研究中發(fā)現(xiàn)，采用磁示蹤法可以檢測(cè)腦深部廣闊區(qū)域的腦細(xì)胞外間隙(brain extracellular space，ECS)，實(shí)現(xiàn)在體、實(shí)時(shí)、全腦尺度的對(duì)腦組織間液(interstitial fluid，ISF)的流動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并發(fā)現(xiàn)ISF在不同腦區(qū)的引流分布范圍不同，存在ISF分區(qū)引流[1-4]。磁示蹤法利用射頻信號(hào)監(jiān)測(cè)可3D動(dòng)態(tài)觀察ISF的流動(dòng)，并同時(shí)檢測(cè)腦組織間隙中水分子的擴(kuò)散參數(shù)[2]，是目前唯一一種可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活體腦間質(zhì)系統(tǒng)(interstitial system, ISS)進(jìn)行三維可視化成像的技術(shù)，但是該方法的分辨率低，有時(shí)無法精確顯示示蹤劑分布的范圍。20世紀(jì)90年代，美國(guó)紐約大學(xué)的一項(xiàng)研究采用光學(xué)示蹤法作為腦細(xì)胞間隙的檢測(cè)手段[4]。光學(xué)示蹤法是利用光學(xué)信號(hào)的一種檢測(cè)手段，由于光的穿透能力有限，因此只能探測(cè)距離腦淺表<200 μm區(qū)域內(nèi)組織間液分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)[5]，且只能在離體狀態(tài)下成像，然而光學(xué)方法分辨率高、成像清晰，可彌補(bǔ)磁共振方法分辨率相對(duì)較低這一缺陷。

光學(xué)方法分辨率高但探測(cè)深度淺，磁示蹤法雖然分辨率低但能實(shí)現(xiàn)全腦活體成像，如果能夠?qū)崿F(xiàn)兩種技術(shù)同步檢測(cè)，將極大地提高研究的準(zhǔn)確性和可信度。本課題組通過化學(xué)合成方法將磁共振成像探針金屬釓離子(Gd3+)與熒光成像探針異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)相連接，合成能在腦組織間隙中磁共振成像與熒光成像效果好的光磁雙模態(tài)探針釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物(Gd-DO3A-EA-FITC)，為腦組織間隙的研究與探索提供了重要的工具[6-7]。

本研究擬對(duì)已有的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，首先通過改變?nèi)〈樞?，使反?yīng)更易控制與操作，從而減少雜質(zhì)生成而使純化過程更加容易，之后對(duì)連接上熒光分子探針后化合物的純化方法進(jìn)行改進(jìn)，將原文獻(xiàn)中載樣量少、成本高的制備型高效液相色譜法改為載樣量多、成本更低的柱層析法，以期待改進(jìn)后更有利于該探針的大量生產(chǎn)，達(dá)到改進(jìn)后將總收率顯著提升的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)和核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)用瑞士Bruker公司avance Ⅲ 400型磁共振儀測(cè)定，四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)為內(nèi)標(biāo)，氘代氯仿(CDCl3)或重水(D2O)為溶劑。電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(electrospray ionization time of flight mass spectrometry，ESI-TOF-MS)用美國(guó)Water公司的Quattro micro 2000型儀器測(cè)定。其他試劑為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2 N-[2-(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基)乙基]-1,1-二甲基乙基酯(3)

室溫下向1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷化合物1(1.7 g、10 mmol、1.0 eq)的氯仿溶液(25 mL)中加入N-Boc-溴乙胺(1.48 g、6.6 mmol、0.66 eq)， 并在此溫度下繼續(xù)攪拌20 h。減壓蒸餾除去溶劑，得到無色透明黏稠油狀物。柱色譜[采用干法上樣，以含有3%(體積分?jǐn)?shù))的三乙胺的洗脫劑DCM/MeOH：20/1→10/1→5/1進(jìn)行梯度洗脫]分離得到白色泡沫狀固體化合物3(2.5 g、79%)。1H NMR (400 MHz、CDCl3)：δ1.40(s,9H)，2.58～2.84(m,18H)，3.18(br,2H)，4.02(br,1.7H)，5.78(br,1H)。13C NMR (100 MHz、CDCl3)：δ28.2, 38.3, 45.9, 46.3, 47.5, 51.4, 54.2, 78.5, 155.8。HRMS (ESI)m/z：316.3[M+H]+，分子式 C15H34N5O2。

1.3 [4,7-雙丁氧羰基-10-(N-Boc-2-氨基乙基)-1,4,7,10-四氮雜吡啶-1-基]-乙酸叔丁酯(4)

室溫下向含有化合物3(466 mg、1.48 mmol、1.0 eq)的乙腈溶液(6 mL)中依次加入溴乙酸叔丁酯(975 mg、0.73 mL、5.0 mmol、3.4 eq)及碳酸鈉(1.22 g、11.5 mmol、7.8 eq), 將反應(yīng)液升溫至60 ℃并在該溫度下繼續(xù)攪拌10 h。將反應(yīng)液進(jìn)行過濾，所得濾液減壓蒸餾除去溶劑，得到黃色透明黏稠油狀物。柱色譜[采用干法上樣，以含有1%(體積分?jǐn)?shù))的三乙胺的洗脫劑PE/EA：20/1→DCM/MeOH：20/1進(jìn)行梯度洗脫]分離得到淡黃色泡沫狀固體化合物4(850 mg、87%)。1H NMR (400 MHz、CDCl3)：δ1.39 (s,9H)，1.42 (s,9H)，1.47 (s,18H)，2.30～3.24 (m,26H)，5.18 (br,1H)。13C NMR (100 MHz、CDCl3)：δ27.03, 27.22, 27.63, 36.94, 49.52, 53.14, 54.90, 55.70, 78.32, 81.63, 81.99, 155.68, 171.79, 172.50。HRMS(ESI)m/z：658.5[M+H]+,分子式 C33H64N5O8。

1.4 [4,7-雙-羧甲基-10-(2-氨基乙基)-1,4,7,10-四氮雜吡啶-1-基]-乙酸(5)

室溫下向含有化合物4(500 mg、0.76 mmol、1.0 eq)的溶液中加入三氟乙酸(3 mL)，攪拌18～20 h，減壓蒸餾除去三氟乙酸，加入甲醇(1 mL)溶解，劇烈攪拌下緩慢滴加乙醚(5 mL)至不再產(chǎn)生固體沉淀，抽濾，固體用玻璃棒碾碎并用大量乙醚沖洗，乙醚揮干即可得到白色粉末固體化合物5(290 mg、98%)。1H NMR (400 MHz、D2O)：δ2.90～3.06(m,12H)，2.27～3.46(m,10H)，3.93 (br.s,4H)。13C NMR (100 MHz、D2O)：δ36.2, 48.4, 49.9, 50.4, 51.9, 52.6, 55.9, 169.9, 175.1, HRMS(ESI)m/z：388.2[M-H]-，分子式 C16H30N5O6。

1.5 [4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸(6)

室溫避光條件下向含有化合物5(300 mg、0.54 mmol、1.0 eq)的四氫呋喃/水(體積比4 ∶1)混合溶液(6 mL)中加入異硫氰酸熒光素異構(gòu)體Ⅰ(209 mg、0.54 mmol、1.0 eq)。用飽和NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)pH值并維持在8.0～8.5，繼續(xù)攪拌2～3 d。波層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去溶劑，加入足量三氟乙酸(6 mL)，室溫下繼續(xù)攪拌24 h。減壓蒸餾除去三氟乙酸直接柱色譜分離(DCM/MeOH=2/1→1/2)，得到紅棕色固體化合物6(223 mg、53%)。1H NMR (400 MHz、D2O)：δ2.52～3.40(m,24H)，3.69 (br.s,2H)，6.51～6.55(m,4H)，7.12～7.14(m,3H), 7.42 (br.d,J=6.8, 1H), 7.57 (br.s,1H)。13C NMR (100 MHz、D2O)：δ43.0, 52.1, 53.1, 53.6, 54.0, 56.0, 59.6, 106.5, 114.9, 125.8, 127.1, 128.2, 131.6, 133.5, 134.1, 143.5, 160.9, 161.2, 176.7, 181.6, 182.4, 183.3。HRMS(ESI)m/z：777.2[M-H]-,分子式 C37H41N6O11S。

1.6 釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物(7)

室溫條件下向化合物6 (130 mg、0.17 mmol、1.0 eq) 溶于水(3 mL)中加入GdCl3·6H2O(74 mg、0.20 mmol、1.2 eq)， 并用飽和NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至7～8。室溫下攪拌6 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后抽濾，固體分別用水和甲醇洗滌，即可得到紅棕色固體化合物7(150 mg、97%)。HRMS(ESI)m/z：934.2[M+H]+,分子式 C37H40N6O11SGd。該化合物經(jīng)高效液相色譜測(cè)定(甲醇-水=5%→70%→100%)純度為98.0%。

2 結(jié)果與討論

目標(biāo)產(chǎn)物化合物7(Gd-DO3A-EA-FITC)具有兩個(gè)部分，即熒光部分和與順磁性金屬結(jié)合的大環(huán)化合物部分。順磁性金屬釓(Gd)是臨床上常用的磁共振成像造影劑，可以進(jìn)一步提高成像的特異性和靈敏度。然而，直接在體內(nèi)引入順磁性金屬離子受固有毒性的限制，用大環(huán)多氨基羧酸鹽作強(qiáng)配體來絡(luò)合這種金屬以防止其毒性。根據(jù)以上原理，為了與三價(jià)釓離子(Gd3+)絡(luò)合，本研究用溴乙酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)在大環(huán)化合物1上進(jìn)行三取代反應(yīng)。由于胺基基團(tuán)具有容易反應(yīng)性的特性，可與多種親電試劑(如醛、羧酸和異硫氰酸酯)形成多種靶向造影劑，如常用的熒光示蹤劑FITC，因此，本研究又在1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(DOTA)的另一取代位點(diǎn)引入胺基基團(tuán)(N-Boc-溴乙胺)，用于連接熒光示蹤劑FITC，從而得到光磁雙模態(tài)分子探針。

釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物(7)原路線[6]如圖1中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五步反應(yīng)，化合物1經(jīng)過三取代反應(yīng)(Ⅰ)、單取代反應(yīng)(Ⅱ)、水解反應(yīng)(Ⅲ)、胺基與異硫氰基偶聯(lián)反應(yīng)(Ⅳ)、與金屬釓離子絡(luò)合反應(yīng)(Ⅴ)，生成光磁雙模態(tài)探針化合物7。其中，化合物1在進(jìn)行三取代反應(yīng)時(shí)，由于易受到滴加速度、攪拌不均勻等不利因素影響，極易發(fā)生四取代反應(yīng)等，使雜質(zhì)增多，加大純化困難?；衔?生成化合物6的偶聯(lián)反應(yīng)中，純化方法采用的是制備型高效液相色譜，其載樣量較小且成本較高，不太適用于大量純化與生產(chǎn)。

針對(duì)上述合成路線中存在的問題，本研究進(jìn)行了相關(guān)合成及純化方法的改進(jìn)(圖1中i、ii、iii、iv、v五步反應(yīng))。先將過量化合物1與N-Boc-溴乙胺進(jìn)行單取代反應(yīng)生成化合物3[8]，該反應(yīng)無需緩慢滴加，產(chǎn)物較純易分離，避免了原路線中易受到滴加速度、攪拌不均勻等不易控制因素的影響，然后與溴乙酸叔丁酯三取代反應(yīng)后得到化合物4[9]，利用三氟乙酸水解后制備的產(chǎn)物5與熒光示蹤劑FITC偶聯(lián)生成化合物6[6]，并通過載樣量大、操作簡(jiǎn)易及成本較低的柱層析方法進(jìn)行純化分離，避免了使用載樣量較小且成本較高的制備型高效液相色譜，解決了載樣量受實(shí)驗(yàn)儀器限制的問題，有利于大量制備。化合物6最后與釓離子絡(luò)合得到目標(biāo)光磁雙模態(tài)探針化合物7。

綜上所述，本研究完成了光磁雙模態(tài)探針釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物(7)合成路線的改進(jìn)，以1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(1)為起始物，經(jīng)過親核取代反應(yīng)、水解反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)、與金屬絡(luò)合反應(yīng)生成釓-[4,7-雙-羧甲基-10-(2-熒光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-基]-乙酸絡(luò)合物(7)。改進(jìn)路線避免了三取代反應(yīng)易受滴加速度、攪拌不均勻等因素的影響，同時(shí)將原路線總收率18.0%顯著提升至 34.6%，并且將載樣量少、成本高的制備型高效液相色譜純化改進(jìn)為載樣量多、簡(jiǎn)便易操作的柱層析純化分離，利于大量生產(chǎn)制備，對(duì)光磁雙模態(tài)探針的合成研究與結(jié)構(gòu)擴(kuò)展具有重要意義。

此光磁雙模態(tài)探針可將在體的磁共振成像與離體的激光掃描共聚焦顯微鏡成像結(jié)果相匹配，可以更好地在細(xì)胞和分子水平闡明ISS內(nèi)的ISF生理引流分區(qū)產(chǎn)生的機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)ISS內(nèi)分區(qū)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和機(jī)制進(jìn)行深入研究[10-14]，并且對(duì)不同病理生理狀態(tài)下ISS內(nèi)的ISF研究提供了一種新的思路與方法[15]。