麥洼牦牛不同生長(zhǎng)階段肝臟差異表達(dá)基因分析

傅芳 王利* 字向東

（1 西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

（2 西南民族大學(xué)，動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

肝臟是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最大的消化腺及代謝器官，利用內(nèi)分泌因子不斷調(diào)節(jié)新陳代謝平衡，在各種營(yíng)養(yǎng)或有害物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和消化液合成等過(guò)程中發(fā)揮重要功能(Schlegelet al.,2012; Shappellet al., 2019; Jalaliet al., 2020)。動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，外源性生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)肝臟的成熟和代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)(徐函等，2018)。已有研究探討了Hippo 信號(hào)通路參與調(diào)控新生仔豬肝臟的生長(zhǎng)代謝(尹聰，2013)，并利用RNA-Seq 技術(shù)分別解析了不同發(fā)育階段豬(賀伸，2017)、雞(Liet al.,2015)等畜禽肝臟組織的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，以理解其生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制和規(guī)律，但不同發(fā)育階段牦牛肝臟組織的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制及其基因的表達(dá)至今未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，研究高原動(dòng)物肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制有助于了解高原哺乳動(dòng)物肝臟生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)化進(jìn)程及遺傳基礎(chǔ)，為牦牛肝臟生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控提供理論依據(jù)。

牦牛(Bos grunniens)分布于青藏高原，能適應(yīng)高海拔高寒低氧的氣候環(huán)境條件，可為人類(lèi)提供優(yōu)質(zhì)的乳、肉、皮、絨等多種畜產(chǎn)品而獲得“高原之舟”之美譽(yù)(Miaoet al., 2015)。麥洼牦牛主要分布在四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的草原牧區(qū)，是我國(guó)動(dòng)物遺傳資源中珍稀的畜種資源和基因庫(kù)(李世林等，2014)。已有研究探索了牦牛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的肺臟(何俊峰等，2009)、腎臟(王婷等，2017) 和皮膚(于川等，2017)等形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化，而在分子水平上的研究?jī)H限于肺臟(Xinet al.,2019)和肌肉(Maet al.,2019; Xinet al., 2019) 的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，未見(jiàn)牦牛肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)研究。因此，本研究對(duì)不同發(fā)育階段的麥洼牦牛肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，旨在深入理解牦牛肝臟組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的變化，為高原牦牛肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)和借鑒。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為1 日齡組(LD)、15 月齡組(LM)和5 歲齡組(LY)的健康麥洼牦牛，每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，體重分別為(12.35 ± 1.85) kg、(98.88 ± 2.50) kg 和(268.55 ± 27.82) kg，2019 年7 月采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣?？崭?4 h 后快速放血處死，取LD 組、LM 組和LY 組麥洼牦牛肝臟組織放入液氮中冷凍，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

用RNAiso Plus(TaKaRa，日本)提取總肝臟組織RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及Nano-Photome‐ter?分光光度計(jì)(Implen，美國(guó))分別檢測(cè)RNA 的完整性和提取質(zhì)量，其OD260/280值為1.8~2.2，則質(zhì)檢合格，可進(jìn)行下一步分析。采用去除核糖體RNA 的方法構(gòu)建本次實(shí)驗(yàn)所需牦牛肝臟組織鏈特異性文庫(kù)(Parkhomchuket al., 2009)，隨后分別使用Qubit2.0 Fluorometer (Invitrogen，美國(guó)) 和Agi‐lent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies，美國(guó))對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步定量及質(zhì)量檢測(cè)，最后采用qRTPCR (Bio-Rad，美國(guó))對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量以保證文庫(kù)質(zhì)量。由北京諾禾致源有限公司使用二代高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina (HiSeqTM2500)(Illumina，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

用HISAT2 v2.0.5 軟件(https://ccb. jhu. edu/software/hisat2/manual. shtml#usage) 將質(zhì)控后的有效測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean Reads) 與牦牛參考基因組(BosGruv2.0：ftp://ftp. ensembl. org/pub/release-97/fasta/bos_mutus/) 進(jìn)行快速精確的比對(duì)。獲得匹配數(shù)據(jù)(Mapping Reads) 后比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，得到各樣品的比對(duì)效率及在基因組上的定位信息(Mortazaviet al., 2008)。 分 別 使 用StringTie(1.3.3b) 軟件和Subread 軟件中的featureCounts 進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本組裝(Perteaet al., 2015) 和基因表達(dá)水平定量分析(Garberet al., 2011; Liaoet al.,2014)，并用FPKM (Fragments Per Kilobase of tran‐script sequence per Millions base pairs sequenced) 對(duì)測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度進(jìn)行了校正(Brayet al.,2016)。基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2 (1.16.1) 軟件對(duì)Read Count 進(jìn)行組間表達(dá)差異基因統(tǒng)計(jì)分析(Loveet al., 2014)，標(biāo)準(zhǔn)為組間樣品|log2 (Fold Change)| > 0 & padj < 0.05。采用層次聚類(lèi)對(duì)基因的FPKM 值進(jìn)行聚類(lèi)分析，對(duì)行進(jìn)行均一化處理。采用Cluster Profiler (3.4.4) 軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析，預(yù)測(cè)其可能參與的生物學(xué)過(guò)程和功能，并進(jìn)行相應(yīng)分類(lèi)及統(tǒng)計(jì)。

1.4 qRT-PCR差異驗(yàn)證

采用qRT-PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的表達(dá)，根據(jù)KEGG 富集分析選擇顯著富集(P=0.000 001 130) 的通路富集基因進(jìn)行驗(yàn)證，以β-actin作為內(nèi)參，引物詳見(jiàn)表1。qRT-PCR 擴(kuò)增體系為10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 2.2 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ5.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3 min；95℃10 s，53.4℃(β-actin)55℃(驗(yàn)證基因)20 s，72℃20 s，共39 次循環(huán)；溶解曲線(xiàn)65℃~ 95℃每5 s增加0.5℃。將qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢驗(yàn)RNA-Seq 數(shù)據(jù)可靠性。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，通過(guò)SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primers information of the genes for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 牦牛肝臟RNA的提取與cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

取牦牛肝臟組織RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可觀(guān)察到兩條清晰的條帶，其OD260/280值為1.92 ~ 2.18，說(shuō)明本次提取的RNA 完整性較高、質(zhì)量較好。文庫(kù)構(gòu)建完成后，測(cè)得各肝臟組織樣本的RNA 濃度均在1 032 ng/μL 以上。將文庫(kù)稀釋至1.5 ng/μL，測(cè)得文庫(kù)有效濃度高于2.0 nmol/L，結(jié)果表明cDNA 文庫(kù)質(zhì)量合格，構(gòu)建成功。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析與注釋

通過(guò)雙端測(cè)序法測(cè)得LD 組、LM 組和LY 組牦牛肝臟轉(zhuǎn)錄組平均每個(gè)測(cè)序樣本約16.07 G、14.73 G 和16.19 G 原始?jí)A基數(shù)(Raw Bases) [約10.72 億條、9.82 億條和10.80 億條原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)]，質(zhì)控后得到約15.48 G、14.14 G 和15.57 G 有 效 測(cè) 序 堿 基 數(shù) (Clean Bases) ( 約10.32 億條、9.42 億條和10.38 億條有效測(cè)序數(shù)據(jù))。測(cè)序所得數(shù)據(jù)堿基錯(cuò)誤率均小于0.03%，且Q20 大于96.44%、Q30 大于91.00%，GC 含量在51.10% ~ 53.22%之間。以上結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)得到了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。將有效測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組(BosGruv2.0) 進(jìn)行序列比對(duì)，獲取其在參考基因組上的位置信息。3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組牦牛肝臟樣本比對(duì)到參考基因組上的匹配數(shù)據(jù)分別占有效測(cè)序數(shù)據(jù)的87.13%、84.42%和81.03%，表明所選參考基因組作為參考進(jìn)行組裝注釋可以滿(mǎn)足分析需求。

2.3 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)與基因表達(dá)水平分析

使用StringTie (1.3.3b) 軟件進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本組裝，組裝后對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Pfam、SUPERFAMI‐LY、GO、KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)共有552 個(gè)新基因(表2)。RNA-Seq 相關(guān)性檢查結(jié)果表明，每組樣品間基因表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.951，即各組樣品之間表達(dá)模式的相似度較高，增加了實(shí)驗(yàn)的可靠性，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表2 部分新轉(zhuǎn)錄本結(jié)果Table 2 Some results of new transcript

2.4 差異表達(dá)基因分析

將LD 組、LM 組和LY 組牦牛肝臟基因表達(dá)水平分析得到的數(shù)據(jù)采用DESeq2(1.16.1)進(jìn)行分析，LD 組 與LM 組 篩 選 出1 144 個(gè)DEGs，其 中634 個(gè)DEGs 在LD 組中表達(dá)較高、510 個(gè)DEGs 在LM 組中表達(dá)較高；LD 組與LY 組篩選出1 228 個(gè)DEGs，其中751 個(gè)DEGs 在LD 組中表達(dá)較高、477 個(gè)DEGs 在LY 組中表達(dá)較高；LM 組與LY 組篩選出483 個(gè)DEGs，其中271 個(gè)DEGs 在LM 組中表達(dá)較高、212 個(gè)DEGs 在LY 組中表達(dá)較高(圖1)。差異基因聚類(lèi)分析結(jié)果表明表達(dá)模式相近的基因(縱坐標(biāo)) 或樣本(橫坐標(biāo)) 聚集效果明顯，即同一基因(縱坐標(biāo)) 在不同樣本(橫坐標(biāo)) 中的表達(dá)情況一致(圖2)。

圖1 不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì). LD：1日齡組；LM：15月齡組；LY：5歲齡組Fig.1 Distribution of differentially expressed genes in yak at dif‐ferent growth stages. LD: 1-day-old; LM: 15-month-old; LY: 5-year-old

圖2 不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟差異表達(dá)基因聚類(lèi)熱圖. 紅色代表高表達(dá)量，藍(lán)色代表低表達(dá)量；LD：1日齡組；LM：15月齡組；LY：5歲齡組Fig. 2 Heat map of cluster of differentially expressed genes in yak at different growth stages. Red and blue represent high and low expres‐sion,respectively;LD:1-day-old;LM:15-month-old;LY:5-year-old

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析

基于上述對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程中差異表達(dá)基因在3個(gè)生長(zhǎng)階段的表達(dá)模式分析，對(duì)3個(gè)生長(zhǎng)階段的高表達(dá)基因進(jìn)行差異表達(dá)基因功能分析，結(jié)果顯示，LD組、LM 組和LY 組中分別有325 個(gè)、85 個(gè)和84 個(gè)表達(dá)水平高于其他兩組的顯著差異表達(dá)基因(圖3)。

圖3 三個(gè)生長(zhǎng)階段兩兩比較分析獲得的高表達(dá)編碼基因數(shù)韋恩圖. LD：1日齡組；LM：15月齡組；LY：5歲齡組Fig.3 Venn diagram of paired comparison of genes with higher expression among stages. LD:1-day-old;LM:15-month-old;LY:5-year-old

根據(jù)GO 功能分類(lèi)富集，將注釋基因分為生物過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellu‐lar component, CC) 和分子功能(molecular func‐tion,MF)三大功能類(lèi)。LD 組、LM 組和LY 組高表達(dá)基因注釋結(jié)果中分別富集到102 個(gè)、104 個(gè)和134 個(gè)顯著差異注釋條目(P< 0.05)，其中分別含有59個(gè)、51個(gè)、67個(gè)BP類(lèi)，8個(gè)、12個(gè)、15個(gè)CC類(lèi)和35 個(gè)、41 個(gè)、52 個(gè)MF 類(lèi)，均選取最顯著的30 個(gè)亞類(lèi)繪制柱狀圖進(jìn)行展示(圖4A、C、E)，結(jié)果顯示其占比最多的GO 條目是氧化還原相關(guān)過(guò)程、發(fā)育過(guò)程和代謝過(guò)程。根據(jù)KEGG 通路富集結(jié)果顯示，LD 組、LM 組和LY 組高表達(dá)基因注釋結(jié)果中分別富集到19 個(gè)、13 個(gè)和19 個(gè)顯著差異注釋信號(hào)通路(P<0.05)，均選取前10 個(gè)顯著KEGG通路繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行展示(圖4B、D、F)，結(jié)果顯示其占比最多的KEGG 通路是PI3K-Akt信號(hào)通路、粘著斑和ECM-受體相互作用。

圖4 不同生長(zhǎng)階段高表達(dá)基因GO富集分析柱狀圖與KEGG富集分析散點(diǎn)圖. A：LD組高表達(dá)基因GO富集；B：LD組高表達(dá)基因KEGG富集；C：LM 組高表達(dá)基因GO 富集；D：LM 組高表達(dá)基因KEGG 富集；E：LY 組高表達(dá)基因GO 富集；F：LY 組高表達(dá)基因KEGG 富集；GO富集分析中橫坐標(biāo)代表GO富集條目，縱坐標(biāo)-log10(P value)代表GO富集條目顯著性水平；KEGG富集分析中點(diǎn)的大小代表注釋到KEGG信號(hào)通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小，橫坐標(biāo)Gene Ratio代表注釋到KEGG 信號(hào)通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)代表KEGG信號(hào)通路；LD：1日齡組；LM：15月齡組；LY：5歲齡組Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis and scatter diagram of KEGG enrichment analysis of highly expressed genes in different growth stag‐es. A: Enrichment of GO in LD group; B: Enrichment of KEGG in LD group; C: Enrichment of GO in LM group; D: Enrichment of KEGG in LM group; E: Enrichment of GO in LY group; F: Enrichment of KEGG in LY group; In enrichment analysis of GO, X-axis represents GO terms and -log10 (P value) of Y-axis represents significance level of GO terms; In enrichment analysis of KEGG, the size of the dots represents the number of genes annotated on KEGG pathways,the color from red to purple represents the significance of the enrichment,and Gene Ratio of X-axis represents the ratio of the number of DEGs annotated to KEGG pathways to the total number of DEGs and Y-axis represents KEGG pathways; LD: 1-day-old;LM:15-month-old;LY:5-year-old

2.6 qRT-PCR差異驗(yàn)證結(jié)果

從高通量測(cè)序結(jié)果中挑選8 個(gè)DEGs(CYP7B1、PGFS2、CYP1A1、UGT2C1-1、UGT2C1L、HSD11B1、CYP2C19、UGT2C1-2) 進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果可知，其擴(kuò)增效率E 值為95% ~ 100%、相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.997 以上，擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)線(xiàn)性關(guān)系滿(mǎn)足分析要求。計(jì)算RNA-Seq 的FPKM 值與qRT-PCR 結(jié)果之間的皮爾遜相關(guān)性，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)r為0.869，滿(mǎn)足分析要求。結(jié)果表明，qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq 測(cè)序結(jié)果一致，表明基于轉(zhuǎn)錄組分析DEGs 的表達(dá)結(jié)果可靠(圖5)。

圖5 RNA-Seq 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證. *代表LM 組與LD 組相比差異顯著P<0.05，#代表LY 組與LD 組相比差異顯著P<0.05；LD：1日齡組；LM：15月齡組；LY：5歲齡組Fig.5 Verification of RNA-Seq by qRT-PCR. *indicates that the difference is significant between LD and LM(P<0.05),#indicates that the dif‐ference is significant between LD and LY(P<0.05);LD:1-day-old;LM:15-month-old;LY:5-year-old

3 討論

在已有的牦牛肝臟轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)研究中，以牦牛肝臟為研究對(duì)象探討鎘脅迫下牦牛肝臟組織轉(zhuǎn)錄組特征(劉祥軍，2017)，但還未見(jiàn)不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)報(bào)道。采用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)1 日齡、21 日齡、2 歲齡的豬肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別篩選出396 個(gè)、260 個(gè)和324 個(gè)表達(dá)水平高于其他兩組的DEGs (賀伸，2017)。對(duì)20 周和30 周的雞肝臟組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別篩選出1 485 個(gè)和1 082 個(gè)高表達(dá)DEGs (Liet al., 2015)。本實(shí)驗(yàn)采用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)1 日齡、15月齡和5歲齡的健康麥洼牦牛肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別篩選出325 個(gè)、85 個(gè)和84 個(gè)表達(dá)水平高于其他兩組的DEGs。與先前研究結(jié)果一致，1 日齡肝臟相比15 月齡和5 歲齡肝臟篩選出的DEGs最多，其原因可能是1日齡與15月齡和5歲齡牦牛之間發(fā)育程度相差較大導(dǎo)致，說(shuō)明1日齡肝臟發(fā)育與15 月齡和5 歲齡相比更為關(guān)鍵。該研究結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟差異表達(dá)基因的變化與生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，為進(jìn)一步探索牦牛肝臟生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)新基因提供參考。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法篩選出了3個(gè)生長(zhǎng)階段牦牛肝臟的差異表達(dá)基因，功能分析的結(jié)果顯示3個(gè)年齡階段髙表達(dá)的基因富集至各個(gè)生長(zhǎng)階段非常重要的生物學(xué)過(guò)程中。對(duì)篩選出的前30項(xiàng)GO條目分析發(fā)現(xiàn)，占比最多的GO 條目是氧化還原相關(guān)過(guò)程、發(fā)育過(guò)程與代謝過(guò)程。氧化還原酶種類(lèi)豐富，作為酶中數(shù)目最多且最重要的一個(gè)分支，廣泛應(yīng)用于生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，并對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)具有重要意義(伍開(kāi)琳和陳永正，2018)。同時(shí)，機(jī)體參與氧化還原反應(yīng)伴隨著大量電子和鐵離子的傳遞和流動(dòng)(Junget al.,2016)。肝臟發(fā)育過(guò)程中，初生時(shí)功能尚不健全，隨著生長(zhǎng)功能逐漸完善，至體成熟階段時(shí)功能健全，代謝來(lái)自食物的各種成分，包括有毒有害物質(zhì)也主要是在肝臟中進(jìn)行(仲召鑫等，2019；石李梅等，2020)。1 日齡與15 月齡的高表達(dá)基因顯著富集至各種氧化還原酶活性、鈣離子結(jié)合等氧化還原相關(guān)過(guò)程和單、多細(xì)胞等發(fā)育過(guò)程中(P<0.05)，表明這兩個(gè)階段的肝臟組織均處于快速生長(zhǎng)發(fā)育的年齡階段。其中，1 日齡時(shí)，部分基因富集至胚胎發(fā)育調(diào)控過(guò)程，表明此時(shí)的肝臟組織還處于胚胎發(fā)育調(diào)控的延伸階段；15 月齡時(shí)，部分基因富集至T細(xì)胞受體信號(hào)通路等免疫過(guò)程中，表明此時(shí)的肝臟組織已經(jīng)承擔(dān)部分機(jī)體的免疫功能。代謝過(guò)程是生命所需的最基本活動(dòng)之一，并參與細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)必不可少的生理活動(dòng)(Lempradlet al., 2015)。肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的中樞器官，是許多物質(zhì)合成、分解和轉(zhuǎn)化等代謝過(guò)程發(fā)生的主要場(chǎng)所(王紹慶，2012)。5 歲齡時(shí)的高表達(dá)基因主要顯著富集至肝臟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝過(guò)程中(P<0.05)，包括氨基酸代謝、小分子代謝等。表明各個(gè)生長(zhǎng)階段高表達(dá)基因顯著富集過(guò)程與肝臟生長(zhǎng)發(fā)育特性和功能相吻合，由此推測(cè)氧化還原酶活性、鈣離子結(jié)合等氧化還原相關(guān)過(guò)程，單、多細(xì)胞等發(fā)育過(guò)程與氨基酸代謝、小分子代謝等代謝過(guò)程在不同發(fā)育階段牦牛肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。

對(duì)篩選出的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號(hào)通路、粘著斑和ECM-受體相互作用占比最多。PI3K-Akt 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)DNA 甲基化在調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境和疾病發(fā)生發(fā)展上發(fā)揮重要作用(梅傳忠，2010；鄧大君，2014)。粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)主要參與整合素激活的FAK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)ECM 途徑浸潤(rùn)?quán)徑M織、發(fā)生粘著斑的動(dòng)態(tài)改變，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展進(jìn)程都發(fā)揮著重要作用(Liuet al.,2018;Weiet al.,2020)。ECM與其相應(yīng)受體結(jié)合后能夠向細(xì)胞發(fā)出信號(hào)從而啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，該信號(hào)傳導(dǎo)在組織器官形態(tài)學(xué)發(fā)生、胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化等過(guò)程中起重要作用(王思源等，2019；Zhanget al., 2020)。而機(jī)體發(fā)育、組織修補(bǔ)和血管生成等多種生理狀態(tài)均需要進(jìn)行膠原代謝降解膠原(包新見(jiàn)，2006)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在PI3K-Akt 信號(hào)通路、粘著斑與ECM-受體相互作用中主要富集了膠原蛋白α 鏈(COLA)家族基因結(jié)果一致。其次，整合素α 亞基(ITGA) 也富集于PI3K-Akt 信號(hào)通路、粘著斑與ECM-受體相互作用中。而整合素可與胞外配體結(jié)合，影響?zhàn)ぶ吲c細(xì)胞骨架結(jié)合形成ECM-整合素-細(xì)胞骨架蛋白的復(fù)合物，介導(dǎo)PI3K-Akt 等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路(楊洪娟，2017)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在PI3K-Akt信號(hào)通路、粘著斑與ECM-受體相互作用中富集了整合素α 亞基(ITGA)家族基因結(jié)果一致。由此可知，PI3K-Akt 信號(hào)通路、粘著斑和ECM-受體相互作用在各生長(zhǎng)階段牦牛肝臟大量富集主要是與細(xì)胞受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)相關(guān)，這也更加說(shuō)明了在不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟生理活動(dòng)在分子層面上表現(xiàn)出的巨大差異性和特殊性。

本研究利用RNA-Seq 技術(shù)探討不同生長(zhǎng)階段牦牛肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制，牦牛肝臟生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程可能是通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、代謝過(guò)程，以及調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路、粘著斑和ECM-受體相互作用信號(hào)通路的基因進(jìn)行，為深入研究高原動(dòng)物肝臟生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。