肝膽腫瘤分子診斷臨床應(yīng)用專家共識

歐美同學(xué)會醫(yī)師協(xié)會肝膽分會；中國研究型醫(yī)院分子診斷醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會；中國臨床腫瘤學(xué)會肝癌專家委員會；中國預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)會肝膽胰疾病預(yù)防

與控制專業(yè)委員會；亞太肝病診療技術(shù)聯(lián)盟肝癌專業(yè)委員會

分子生物學(xué)診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)、混合癌(HCC-CCA)在內(nèi)的原發(fā)性肝癌(primary liver cancer, PLC)及膽管癌、膽囊癌等原發(fā)于膽系的惡性腫瘤的臨床診斷、療效評估、預(yù)后判斷等各個(gè)方面。鑒于現(xiàn)有的包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、免疫組化、基因芯片、基因測序在內(nèi)的諸多實(shí)驗(yàn)手段易受標(biāo)本采集、保存、核酸提取、測序深度、試劑和儀器質(zhì)量、結(jié)果分析判讀等許多因素的影響，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)會已相繼出臺部分共識及指南，以推動分子生物學(xué)前沿成果在臨床中的應(yīng)用。為了完善和規(guī)范肝膽腫瘤相關(guān)分子生物學(xué)診療技術(shù)及臨床實(shí)踐應(yīng)用的各個(gè)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步提升其臨床效能的發(fā)揮，我們在系統(tǒng)總結(jié)臨床及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國實(shí)際，經(jīng)過多次討論形成了本共識。本共識旨在為肝膽腫瘤的分子診斷提供規(guī)范及建議，并為推廣分子生物學(xué)診斷技術(shù)的臨床標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 診斷相關(guān)的主要分子標(biāo)志物

1.1 臨床應(yīng)用的血清學(xué)分子標(biāo)志物

1.1.1 甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3) 血清AFP及其異質(zhì)體AFP-L3是臨床上應(yīng)用最廣泛和特異性最強(qiáng)的HCC標(biāo)志物，國內(nèi)常用于HCC患者的普查、早期診斷、術(shù)后監(jiān)測和隨訪?；瘜W(xué)發(fā)光免疫、ELISA和電化學(xué)發(fā)光法是其臨床常用的檢測方式。對于AFP≥400 ng/ml超過1個(gè)月，排除妊娠、生殖腺胚胎癌和活動性肝病的患者，應(yīng)高度考慮HCC，其診斷特異性高達(dá)99%，而敏感性僅為17%[1]。對于AFP陰性的患者，要定期檢測和動態(tài)觀察，并要借助影像學(xué)檢查或穿刺活檢等手段來明確診斷。AFP-L3在臨床常用親和吸附離心管法檢測。研究顯示,在AFP不升高的情況下，有34.3%的HCC患者，在確診1年前即出現(xiàn)AFP-L3升高。當(dāng)以10%為AFP-L3的臨界值時(shí)，其對早期HCC的檢測敏感性為22%～33%，特異性為93%～94%。對于AFP陰性(<20 ng/ml)HCC患者，AFP-L3的檢測敏感性為12%～21%，特異性為97%～98%[2]。2005年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)將AFP-L3監(jiān)測應(yīng)用于HCC預(yù)警，并把AFP-L3≥10%作為診斷HCC的高特異性指標(biāo)。

1.1.2 脫-γ-羧基凝血酶原(DCP) DCP是一種不正常的凝血酶原分子。在HCC中，由于癌細(xì)胞不能正常合成凝血酶原前體，同時(shí)凝血酶原前體羧化不足，從而生成大量的DCP。目前廣泛采用ELISA試劑盒來檢測DCP，亦可采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測DCP。研究發(fā)現(xiàn)，DCP ≥ 40 mAU/ml診斷早期HCC的敏感性和特異性分別為74%和86%。日本指南建議將DCP聯(lián)合AFP、AFP-L3作為HCC早期診斷和篩查的標(biāo)志物[3]。

1.1.3 糖類抗原19-9 糖類抗原19-9蛋白是一種臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，在正常的膽管、胰腺、胃和結(jié)腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。上述部位的疾病均能引起糖類抗原19-9表達(dá)升高。其常用檢測方法為微粒子酶免法(MEIA)和ELISA。糖類抗原19-9≥37 kU/L時(shí)，聯(lián)合影像學(xué)診斷CCA的敏感性為77.4%，特異性為84.7%；糖類抗原19-9≥100 kU/L提示CCA患者預(yù)后不良[4]；出現(xiàn)梗阻性黃疸癥狀時(shí)，糖類抗原19-9診斷特異性降低。膽道引流減黃后，患者糖類抗原19-9仍維持高值，提示CCA可能性大[5]。糖類抗原19-9≥20 kU/L診斷膽囊癌的敏感性為50%，特異性為92.7%[4]。

1.1.4 癌胚抗原 癌胚抗原是一種參與細(xì)胞黏附的細(xì)胞表面糖蛋白，是結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志，也是肺癌的預(yù)后標(biāo)志物，在健康成人血液中難以檢測到。因其易受吸煙等因素影響，故無法作為CCA的獨(dú)立診斷或預(yù)后標(biāo)志物。臨床常用放射免疫檢測或ELISA方法對血清癌胚抗原進(jìn)行定量。癌胚抗原≥5 ng/ml時(shí)，診斷CCA的敏感性為33%，特異性為85%；癌胚抗原≥4 ng/ml時(shí)，診斷膽囊癌的敏感性為79.4%，特異性為79.2%[4]。目前傾向推薦腫瘤標(biāo)志物糖類抗原19-9聯(lián)合癌胚抗原和糖類抗原125，以提高CCA鑒別診斷率[5](其中糖類抗原125≥35 kU/L)。

1.2 臨床應(yīng)用的病理組織學(xué)分子標(biāo)志物 HCC的組織學(xué)分子標(biāo)志物主要包括肝細(xì)胞抗原(HepPar)-1、磷脂酰肌醇聚糖(GPC-3)、精氨酸酶-1、AFP、低分子角蛋白(CK)8和CK18，其中HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和AFP特異性較好，而CK7、CK19是正常小葉間膽管的標(biāo)志物，因此可作為CCA的標(biāo)志物。在少數(shù)HCC中，CK19和CK7也可表達(dá)，而表達(dá)時(shí)則提示患者預(yù)后不良。在HCC的早期診斷方面，聯(lián)合應(yīng)用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶具有重要診斷價(jià)值，這3個(gè)免疫標(biāo)志物中2項(xiàng)陽性則考慮為HCC。CCA的主要組織學(xué)診斷標(biāo)志物包括CK7、CK19、熱休克蛋白70、黏蛋白-1。基于抗原-抗體免疫反應(yīng)的免疫病理檢測，并密切結(jié)合形態(tài)學(xué)，已成為PLC病理診斷與鑒別診斷的常規(guī)手段。

1.3 處于探索階段的血清學(xué)分子標(biāo)志物

1.3.1 高爾基蛋白(GP)73 GP73是上皮細(xì)胞特異性的跨膜蛋白，在正常肝臟匯管區(qū)周圍的膽管上皮細(xì)胞低表達(dá)，在大部分的正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，在肝組織病變時(shí)表達(dá)上調(diào)。HCC患者外周血GP73水平更是明顯升高。臨床上常用ELISA方法檢測GP73。當(dāng)血清GP73≥10 U/ml(相對值)時(shí)，診斷HCC的敏感性為69%，特異性為75%[6]。需要注意的是，GP73并不是一個(gè)HCC特異性標(biāo)志物，它在腎細(xì)胞癌、前列腺癌中都有表達(dá)。同時(shí)，血清GP73升高不顯著時(shí)，需與肝硬化相鑒別。

1.3.2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)-3 GPC-3是一種細(xì)胞膜表面蛋白聚糖，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，可用ELISA或放射免疫法檢測。在乙型肝炎和丙型肝炎患者血清中，GPC-3≥300 ng/ml診斷HCC的敏感性為53%，特異性為77%。在患者HCC組織中，免疫組化檢測GPC-3陽性時(shí)，診斷HCC的敏感性為97.7%，特異性為91.3%[7]。

1.3.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)突變 ctDNA是腫瘤細(xì)胞釋放到外周血中的游離DNA。應(yīng)用ctDNA的特征性突變結(jié)合血清蛋白標(biāo)志物檢查，可以診斷出卵巢、肝臟、胃、胰腺、食道、結(jié)腸、肺或乳腺等8種常見腫瘤[8]，檢出陽性率的中位值為70%，其中HCC的陽性檢出率達(dá)到96.1%。在不依賴臨床信息的情況下，上述方法可以鑒定出44% HCC患者，聯(lián)合臨床信息檢出率可達(dá)到63%。另一項(xiàng)聯(lián)合了ctDNA檢查的HCC高頻突變與血清中AFP、DCP水平檢測開發(fā)的“HCC篩查系統(tǒng)”，可以從HBsAg陽性的無癥狀慢性乙型肝炎人群中篩查出HCC患者，其診斷敏感性85%，特異性93%，并有助于提前發(fā)現(xiàn)潛在的HCC患者，其診斷敏感性100%，特異性94%[9]。

1.3.4 ctDNA甲基化 DNA甲基化的改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且這種改變被認(rèn)為發(fā)生在遺傳學(xué)改變之前。外周血ctDNA的甲基化檢測，是近年腫瘤另一種無創(chuàng)早期診斷方法。研究顯示，對組織和外周血樣本差異性甲基化位點(diǎn)結(jié)合臨床特征所構(gòu)建的診斷模型，對于鑒別HCC的敏感性達(dá)84.8%，特異性為93.1%，同時(shí)有助于預(yù)測腫瘤的分期、療效和復(fù)發(fā)[10-11]。在2019年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)年會上公布的一項(xiàng)大樣本多中心臨床試驗(yàn)顯示，用HCC等20余種腫瘤及健康志愿者外周血甲基化測序后構(gòu)建的腫瘤早篩預(yù)測模型，腫瘤診斷的總體特異性為99.4%，敏感性為54.7%。

1.3.5 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT) TERT基因啟動子區(qū)突變在大多數(shù)腫瘤中都存在。在膽囊癌中TERT啟動子突變頻率為9.1%；在肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, ECC)中出現(xiàn)的頻率為6.7%；在HCC中出現(xiàn)的頻率為0.5%～57.2%；TERT啟動子區(qū)變異在低級別和高級別肝臟增生性結(jié)節(jié)中經(jīng)常出現(xiàn)，被認(rèn)為是HCC發(fā)生的早期分子事件，可作為潛在的輔助臨床診斷標(biāo)志物[12]。

1.3.6 微小RNA 微小RNA是由21～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，具有組織特異性、腫瘤特異性、可由外泌體途徑分泌入血及穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，已被發(fā)現(xiàn)在HCC診斷和協(xié)同診斷中具有重要作用。血漿中檢測到的微小RNA，包括微小RNA-122、192、21、223、26a、27a、801等，可鑒別診斷HCC,其受試者工作特征曲線下面積為0.84～0.94[13]。同時(shí)微小RNA-26a在HCC組織中低表達(dá)的患者，可以在肝癌切除術(shù)后的干擾素輔助治療中顯著獲益[14]。

1.4 專家推薦意見

(1)建議使用血清學(xué)AFP、AFP-L3以及DCP聯(lián)合檢測，結(jié)合患者影像學(xué)表現(xiàn)，作為臨床HCC篩查、診斷的標(biāo)志物。

(2)建議結(jié)合組織形態(tài)學(xué)，病理組織檢測HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和AFP，作為HCC診斷的免疫標(biāo)志物；聯(lián)合應(yīng)用GPC-3、熱休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶作為早期HCC臨床病理診斷(3項(xiàng)免疫標(biāo)志物中2項(xiàng)陽性)的免疫標(biāo)志物；CK7、CK19和黏蛋白-1作為CCA臨床病理診斷的免疫標(biāo)志物。

(3)建議使用血清學(xué)糖類抗原19-9、125及癌胚抗原聯(lián)合檢測，結(jié)合影像學(xué)特點(diǎn)作為CCA臨床診斷的標(biāo)志物。

(4)建議使用血清學(xué)糖類抗原19-9檢測，結(jié)合影像學(xué)特點(diǎn)作為膽囊癌臨床診斷的標(biāo)志物。

(5)ctDNA、微小RNA等血清學(xué)標(biāo)志物，由于檢測成本較高，且缺乏大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果論證，缺乏組織和腫瘤特異性特征，建議可作為肝膽腫瘤患者診斷及篩查的參考指標(biāo)。

(6)建議肝膽腫瘤根治性治療術(shù)后，參考使用上述血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)合影像學(xué)檢查進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

2 治療相關(guān)的標(biāo)志物

2.1 靶向治療相關(guān)的分子標(biāo)志物

2.1.1 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A VEGFA基因?qū)儆赑DGF/VEGF生長因子家族。它編碼一種肝素結(jié)合蛋白，并能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，是生理和病理狀態(tài)下血管生成所必需。該基因在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與腫瘤分期及進(jìn)展相關(guān)?；跓晒庠浑s交結(jié)果估計(jì)，HCC患者中VEGFA擴(kuò)增率為7%～11%，高VEGF血漿水平與較差的生存期相關(guān)[15]。一項(xiàng)回顧性臨床研究[16]提示，攜帶VEGFA基因擴(kuò)增的晚期HCC患者，對索拉非尼治療有較好的反應(yīng)性。

2.1.2 RAS基因 一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，接受索拉非尼與MEK抑制劑Refametinib(BAY 86-9766)聯(lián)合治療不可切除的東亞HCC患者，4例(5%)血漿中出現(xiàn)KRAS突變的患者有3位確定為部分緩解(PR)，響應(yīng)持續(xù)時(shí)間分別為128、335和382 d，提示攜帶RAS突變的HCC患者與RAS野生型患者相比，對索拉非尼與Refametinib聯(lián)合治療有更好的臨床反應(yīng)性[17]。

2.1.3 MET基因 在多種惡性腫瘤中，MET基因的突變或者擴(kuò)增，會持續(xù)激活c-MET信號，使細(xì)胞增殖失控并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。MET突變在HCC中的發(fā)生頻率約為1.89%；在CCA中的突變頻率約為1.44%。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者的腫瘤組織中c-MET表達(dá)水平較高，并與索拉非尼的耐藥相關(guān)；高表達(dá)c-MET的HCC細(xì)胞中，卡博替尼能夠高效抑制MET活性，抑制血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。

2.1.4 TP53基因 TP53是惡性腫瘤中最常見的突變基因，在超過50%的腫瘤中檢測到該基因的突變，同時(shí)，其突變被認(rèn)為與多種腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。晚期HCC患者腫瘤組織中可檢測到TP53(35%)和WNT/β-catenin信號通路突變(45%)，并且表現(xiàn)為相互獨(dú)立的分子亞型[19]。TP53在早期復(fù)發(fā)與無早期復(fù)發(fā)患者存在差異(P=0.057)。WNK2、RUNX1T1、CTNNB1、TSC1與HCC患者根治性切除術(shù)后早期腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)[20]。目前國內(nèi)外尚無批準(zhǔn)靶向TP53基因的抗腫瘤藥物，但WEE1抑制劑AZD1775在TP53突變的實(shí)體瘤患者中正在展開臨床試驗(yàn)[21]。

2.1.5 纖維母細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)19FGF19基因編碼的蛋白是FGF家族成員，參與人體胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)、腫瘤生長和侵襲等多種生物學(xué)過程。5%～14%的HCC中存在FGF19、CCND1(染色體11q13中的增加)異常，且其高表達(dá)水平和患者不良預(yù)后相關(guān)[22]。CCND1與FGF19共享基因組基因座，常在癌癥中擴(kuò)增。2019年，美國臨床腫瘤學(xué)會會議報(bào)道，高選擇性的共價(jià)FGFR4抑制劑(H3B-6527)對于HCC治療耐受性良好，可使FGF19信號傳導(dǎo)發(fā)生變異的HCC-CCA患者獲益(NCT02834780)。

2.1.6 異檸檬酸脫氫酶1/2(IDH1/IDH2) IDH基因突變見于膠質(zhì)瘤、急性髓細(xì)胞性白血病、肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)等多種癌癥。IDH1/IDH2突變在ICC中的出現(xiàn)頻率為10%～23%[23]，IDH1 R132位點(diǎn)的點(diǎn)突變較為常見。IDH基因突變與ICC患者預(yù)后顯著相關(guān)，發(fā)生IDH1/IDH2基因突變的患者3年存活率為33%，而IDH1/IDH2野生型的患者3年存活率為81%(P=0.003)[24]。2019歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會報(bào)道，IDH抑制劑Ivosidenib治療CCA的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，與安慰劑相比，Ivosidenib顯著改善晚期IDH1突變的CCA患者的無進(jìn)展生存期(PFS,P<0.001)，總生存期(OS)也有獲益。

2.1.7 PI3K/mTOR信號通路 PI3K/mTOR信號通路相關(guān)的基因有PIK3CA、PTEN、STK11、TSC1、TSC2、MTOR等，是肝膽腫瘤中最重要的信號通路之一。在HCC中，PIK3CA突變頻率約為4%，PTEN缺失突變頻率約為7%。文獻(xiàn)報(bào)道PIK3CA基因變異出現(xiàn)的頻率為4%～7.5%[25]。臨床研究提示，PI3K、Akt和mTOR抑制劑可以作為PIK3CA突變的腫瘤患者潛在的治療靶點(diǎn)(NCT00962611、NCT02449538等)。多種PI3K抑制劑，包括Buparlisib、Taselisib和Apitolisib等正在PIK3CA激活變異、PTEN突變的肝膽系統(tǒng)腫瘤中開展臨床試驗(yàn)。依維莫司一線治療進(jìn)展期膽道腫瘤的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，其12周疾病控制率(DCR)為48%，治療耐受性良好。依維莫司作為一線單一療法在晚期膽道腫瘤中表現(xiàn)出了較好的臨床效果[26]。另外，有研究認(rèn)為，PTEN缺失可能與PD-1/PD-L1抑制劑耐藥相關(guān)，但尚需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證[27]。

2.1.8 同源重組修復(fù)缺陷(homologous recombination deficiency, HRD) HR是DNA損傷修復(fù)的機(jī)制之一。當(dāng)某個(gè)或多個(gè)同源重組修復(fù)基因發(fā)生變異時(shí)，可能導(dǎo)致HRD。HR通路涉及的基因包括BRCA1/2、PALB2、ATM、ATR、CHEK1/2、BARD1、BRIP1、MRE11A、RAD51基因家族和FANC基因家族等。根據(jù)2018年美國癌癥研究協(xié)會一項(xiàng)實(shí)體腫瘤HRD與腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)相關(guān)性研究(No.1369)結(jié)果，HRD在HCC和CCA中的發(fā)生頻率分別為28.7%和20.8%，靶向抑制PARP已成為BRCA1/2或PALB2基因缺陷腫瘤的潛在治療策略。攜帶BRCA1/2突變的患者(7例ICC，1例HCC)，在多種治療失敗后用PARP抑制劑奧拉帕尼治療，3例患者部分緩解(PR)，2例患者病情穩(wěn)定(SD)達(dá)3～5個(gè)月[28]。

2.1.9 纖維母細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR) FGFR家族受體成員FGFR1-3編碼成纖維細(xì)胞生長因子受體1-3，F(xiàn)GF/FGFR激活突變、擴(kuò)增或基因融合會導(dǎo)致FGFR持續(xù)激活，促進(jìn)多種腫瘤進(jìn)展。11%的ICC和3%的膽囊癌可檢測到FGFR1-3基因變異[29]。在11%～45%的CCA中檢測到FGFR2基因融合，常見形式主要有FGFR2-ZMYM4、FGFR2-BICC1融合等[30]。FDA已批準(zhǔn)如厄達(dá)替尼、侖伐替尼、瑞戈非尼、普納替尼、培唑帕尼等多種FGFR的激酶抑制劑用于腫瘤的臨床治療。晚期/轉(zhuǎn)移性或手術(shù)無法切除CCA患者的二線治療臨床試驗(yàn)(FIGHT-202)顯示，F(xiàn)GFR2基因易位的CCA患者Pemigatinib(INCB54828)臨床治療效果顯著，客觀緩解率(ORR)達(dá)40%，其中40%PR，45%SD；DCR為85%，中位無進(jìn)展生存期(mPFS)為9.2個(gè)月，中位總生存期為15.8個(gè)月(NCT02924376)。另一FGFR抑制劑BGJ398在FGFR變異(48例FGFR2融合、8例突變和3例基因擴(kuò)增)的晚期CCA患者中開展的Ⅱ期二線臨床試驗(yàn)(NCT02150967)顯示，ORR為14.8%(在FGFR2融合患者中為18.8%)，DCR為75.4%(在FGFR2融合患者中為83.3%)，mPFS5.8個(gè)月[31]。普納替尼、瑞戈非尼在膽道腫瘤的臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中。

2.1.10 ERBB2基因 ERBB2(又名HER2/neu)基因，屬于人類表皮生長因子受體家族(human epithelial factor receptor, HER)。該家族包括4個(gè)成員：EGFR、HER2、HER3以及HER4，均編碼跨膜受體酪氨酸激酶，參與生長因子介導(dǎo)的致癌信號級聯(lián)放大傳遞。HER2基因突變在CCA中發(fā)生頻率約為3.9%，在膽囊癌中約為11.0%[32]。研究顯示，HER2在膽囊上皮中的持續(xù)表達(dá)能夠?qū)е孪侔┑陌l(fā)生。膽囊癌中，12.8%患者存在HER2蛋白過表達(dá)，而且過表達(dá)的患者5年OS相對較差?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，HER2基因擴(kuò)增或過表達(dá)的膽囊癌患者(8例)使用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗和拉帕替尼治療，3例為SD，4例為PR，1例為CR[33]。1例HER2過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性膽囊癌患者使用曲妥珠單抗治療后，其病情緩解持續(xù)時(shí)間為4個(gè)月[34]；1例攜帶HER2擴(kuò)增的轉(zhuǎn)移性CCA患者經(jīng)曲妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇治療后，臨床療效顯著[35]。

2.1.11 BRAF基因 BRAF為編碼RAF蛋白激酶的家族成員之一，主要參與MAP激酶級聯(lián)反應(yīng)，該信號激活能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、生存、遷移和分化。據(jù)報(bào)道，膽道腫瘤中BRAF突變頻率的差異很大：膽囊癌的變異頻率為0～33%，CCA的變異頻率為0～22%[36]。最常見的BRAF基因變異是V600E突變，位于BRAF基因激酶激活域。V600E突變的BRAF激酶活性大約是非突變型的500倍，可持續(xù)激活下游MEK/ERK信號通路。FDA批準(zhǔn)達(dá)拉非尼、維莫非尼和Encorafenib，以及MEK抑制劑曲美替尼、卡博替尼和Binimetinib等BRAF抑制劑單藥或聯(lián)合治療多種攜帶BRAF V600位點(diǎn)突變的腫瘤。BRAF V600E突變還與BRAF抑制劑(維莫非尼、達(dá)拉非尼等)敏感性增強(qiáng)有關(guān)[37]。達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療BRAF V600E突變的CCA患者，ORR達(dá)41%，且安全可耐受(NCT02034110)。

2.2 免疫治療相關(guān)的分子標(biāo)志物

2.2.1 程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed cell death ligand, PD-L1) PD-L1常見于表達(dá)在腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面，具有誘導(dǎo)免疫逃逸的功能；體內(nèi)也存在細(xì)胞外的游離型PD-L1，分為可溶性PD-L1分子(sPD-L1)和外泌體型PD-L1。sPD-L1被證實(shí)與多種腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)。血清外泌體型PD-L1升高能激活腫瘤的免疫逃逸，導(dǎo)致PD-1/PD-L1單抗療效不佳[38]。大量臨床試驗(yàn)表明，組織中PD-L1表達(dá)陽性是免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效評估和患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，但對于PD-L1檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)，不同癌種的不同抗體有不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前，研究數(shù)據(jù)表明對該結(jié)果存在爭議，而肝膽腫瘤中尚未見明確結(jié)論。

2.2.2 TMB TMB是指腫瘤基因組中平均1Mb范圍內(nèi)所包含的體細(xì)胞蛋白編碼區(qū)點(diǎn)突變、插入缺失等基因變異數(shù)量。高TMB與多種因素相關(guān)，如DNA聚合酶POLE和POLD1的DNA“校對”結(jié)構(gòu)域的突變、錯(cuò)配修復(fù)缺陷(mismatch repair deficient, dMMR)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)等。高TMB與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療腫瘤較好的臨床響應(yīng)相關(guān)[39]，這種獲益可能與高TMB患者腫瘤細(xì)胞新抗原增加有關(guān)。晚期HCC患者TMB中位值約為4個(gè)突變/Mb，95%的患者TMB<10個(gè)突變/Mb，6.89%樣本TMB≥10個(gè)突變/Mb。PD-1抑制劑治療HCC的研究報(bào)道1例(5.8%)患者(TMB=15個(gè)突變/Mb，MSI低)對納武利尤單抗保持完全應(yīng)答狀態(tài)持續(xù)超過2年[40]。另有個(gè)案報(bào)道也顯示免疫聯(lián)合治療對PD-L1(+)/TMB-H的ICC患者療效明顯[41]。

2.2.3 MSI及堿基錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR) MMR相關(guān)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的功能失活可導(dǎo)致MSI-H，表現(xiàn)為堿基插入或缺失產(chǎn)生的基因組中簡單重復(fù)序列(微衛(wèi)星)長度的改變。一項(xiàng)晚期HCC基因組測序研究報(bào)道，僅發(fā)現(xiàn)0.2%的患者M(jìn)SI-H。NCCN指南中推薦，對于不可切除和轉(zhuǎn)移性CCA患者，推薦增加分子檢測，包括MMR檢測，并推薦帕博利珠單抗用于MSI-H/dMMR的ICC、ECC和膽囊癌患者[42]。

2.2.4 特定的基因變異 特定基因的突變可能影響腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的能力。在不同腫瘤中免疫相關(guān)的特定的基因變異，如STK11/LKB1、POLE的激活突變、B2M的雜合性缺失等，可預(yù)測免疫治療應(yīng)答率。Wnt/CTNNB1突變是HCC免疫排斥亞型的特征[43]，具有Wnt-β-catenin通路突變的HCC患者對免疫檢查點(diǎn)抑制治療耐藥，其中位生存期較差(突變患者為9.1個(gè)月，未突變患者15.2個(gè)月)。

2.3 專家推薦意見

(1)整體來說，對于肝膽腫瘤，無論靶向治療(索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等)還是免疫治療(PD-1單抗、PD-L1單抗、CTLA-4單抗等)，均無明確的標(biāo)志物能夠預(yù)測患者療效和預(yù)后。臨床實(shí)踐中，不推薦在靶向治療或/和免疫治療前常規(guī)行基因篩查檢測。

(2)HCC靶向治療(索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等)前，不推薦常規(guī)進(jìn)行基因篩查預(yù)測療效，但可結(jié)合臨床實(shí)際情況或臨床試驗(yàn)，對患者進(jìn)行RAS、MET、HRD、VEGFA等基因檢測，為HCC耐藥后治療以及聯(lián)合治療提供參考依據(jù)。

(3)臨床中可結(jié)合實(shí)際情況或臨床試驗(yàn)，嘗試對CCA/膽囊癌患者進(jìn)行FGFR、ERBB2、BRAF、IDH、HRD、PI3K/mTOR、FGF19等基因檢測，探索患者個(gè)體化靶向治療的新方案。

(4)肝膽腫瘤免疫治療前(PD-1單抗、PD-L1單抗、CTLA-4單抗)不建議通過常規(guī)基因篩查選擇免疫治療優(yōu)選人群。但可結(jié)合臨床實(shí)際情況或者臨床試驗(yàn)，對患者進(jìn)行組織學(xué)或血清學(xué)PD-L1、TMB、MSI等檢測，探索免疫治療有效的分子診斷標(biāo)志物。

(5)所有標(biāo)志物的檢測，僅為肝膽腫瘤靶向和/或免疫治療提供臨床參考。由于肝膽腫瘤基因異質(zhì)性、個(gè)體差異性、免疫微環(huán)境等多種影響因素存在，即使是由具有分子生物學(xué)背景、臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的資深醫(yī)師指導(dǎo)治療，亦無法保證所有患者的臨床獲益。迫切需要開展多中心、大規(guī)模臨床試驗(yàn)，以明確肝膽腫瘤靶向和/或免疫治療過程中的有效分子標(biāo)志物。

3 腫瘤標(biāo)志物的檢測質(zhì)控

3.1 血清腫瘤標(biāo)志物 國家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《常用血清腫瘤標(biāo)志物檢測的臨床應(yīng)用和質(zhì)量管理》規(guī)范了各種標(biāo)志物的應(yīng)用以及質(zhì)控、報(bào)告的注意事項(xiàng)等各個(gè)方面，應(yīng)注意患者進(jìn)行血液樣本采集時(shí)的生理變化、疾病情況、不良嗜好以及用藥情況等。血液樣本應(yīng)避免溶血、樣本污染。采集后應(yīng)及時(shí)處理，根據(jù)需要選擇儲存條件，避免反復(fù)凍融。腫瘤標(biāo)志物檢測的方法很多，腫瘤標(biāo)志物的連續(xù)檢測、判斷療效或復(fù)發(fā)監(jiān)測時(shí)應(yīng)使用同一檢測系統(tǒng)進(jìn)行，以保證測定結(jié)果的可比性。實(shí)驗(yàn)室要求詳見：臨床實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評價(jià)要求(GB/T20470)、室間質(zhì)量評價(jià)結(jié)果應(yīng)用指南(WS/T414)、臨床實(shí)驗(yàn)室對商品定量試劑盒分析性能驗(yàn)證(WS/T420)及臨床檢驗(yàn)定量測定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證(WS/T492)等。

3.2 病理免疫組化

(1)病理申請單上應(yīng)包含患者的基本信息、采集標(biāo)本的部位、方法(穿刺、活檢、手術(shù)等)，盡可能將腫瘤標(biāo)本在離體30 min以內(nèi)完整送達(dá)病理科進(jìn)行切開固定。

(2)注意使用試劑的保存(避免反復(fù)凍融、污染等)，建立組織處理、免疫組化切片、抗原修復(fù)、染色操作等的標(biāo)準(zhǔn)化流程。

(3)嚴(yán)格按照相關(guān)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，最大限度規(guī)避因主觀因素造成的結(jié)果差異[44]。

(4)病理報(bào)告建議除常規(guī)病理結(jié)果、免疫組化結(jié)果、典型圖片外，建議包含與肝臟惡性腫瘤潛在藥物靶點(diǎn)檢測、生物學(xué)行為評估以及預(yù)后判斷等相關(guān)的分子病理學(xué)結(jié)果。

3.3 二代測序(next generation sequencing, NGS)實(shí)驗(yàn)過程及檢測報(bào)告的要求

3.3.1 實(shí)驗(yàn)過程的要求

(1)NGS需建立并遵循流程質(zhì)量管理體系文件，便于查詢及追溯。

(2)NGS實(shí)驗(yàn)室需制定防污染措施及控制。實(shí)驗(yàn)室操作應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489-2008)[45]，進(jìn)行定期通風(fēng)及紫外照射處理。實(shí)驗(yàn)操作過程中，要嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分、擦拭實(shí)驗(yàn)用品等避免交叉污染。

(3)NGS分析過程樣本質(zhì)量要求[46]。A接收樣本類型可選用福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊、石蠟包埋標(biāo)本和血漿/血液標(biāo)本等。B樣本接收后需由病理專業(yè)人員對其進(jìn)行檢查，以進(jìn)一步明確樣本取樣來源及腫瘤含量占比。C核酸提?。盒枋褂媒?jīng)過驗(yàn)收合格的試劑對檢測類型進(jìn)行抽提。實(shí)驗(yàn)耗材應(yīng)一次性使用，避免污染。抽提好的DNA需經(jīng)過凝膠電泳、定量等鑒定其結(jié)果是否滿足后續(xù)測序。D構(gòu)建文庫：將提取合格的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，對其進(jìn)行目的基因的抓取，得到的文庫進(jìn)行質(zhì)檢查看其峰形及總量的占比。E測序上機(jī)：添加質(zhì)控樣品作為參照，選取合適的測序平臺及芯片對樣本進(jìn)行測序。

3.3.2 檢測報(bào)告的要求

(1)陽性變異判讀。明確陽性變異位點(diǎn)，包括點(diǎn)突變、插入缺失、拷貝數(shù)變化及結(jié)構(gòu)變異等。尤其是對于串聯(lián)重復(fù)序列的插入缺失突變；構(gòu)建自己實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的假陽性數(shù)據(jù)庫，有效剔除假陽性；規(guī)范命名，命名建議遵循人類基因組變異學(xué)會命名規(guī)則。

(2)變異分類。篩選臨床相關(guān)變異：A明確變異分類的標(biāo)準(zhǔn)，包括已知報(bào)道變異、新發(fā)變異等。B依照臨床證據(jù)對變異的腫瘤相關(guān)性(治療、診斷、預(yù)后)分析，證據(jù)等級評定。

(3)對臨床意義明確變異進(jìn)行詳細(xì)解釋。A結(jié)合證據(jù)等級進(jìn)行用藥推薦(國內(nèi)外相應(yīng)規(guī)范，專家共識等)，變異功能注釋做到客觀、準(zhǔn)確、嚴(yán)謹(jǐn)。B報(bào)告的基本內(nèi)容板塊可以參考《臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室二代基因測序檢測專家共識》中的結(jié)果解釋及報(bào)告[46]。C.復(fù)核是否有文字錯(cuò)誤。

(4)其他。對于動態(tài)監(jiān)測的患者，需結(jié)合既往NGS檢測結(jié)果比較分析。

4 小結(jié)

結(jié)合HCC患者基因表達(dá)、突變水平，推薦將HCC分為增殖型和非增殖型。增殖型HCC一般具有HBV感染的背景，且AFP很高，腫瘤進(jìn)展更快、惡性程度更高，患者預(yù)后更差。非增殖型HCC一般是由于HCV感染或酒精性肝病所致，患者預(yù)后相對較好[47]。另一方面，聯(lián)合患者體內(nèi)TMB與T細(xì)胞炎癥基因(PD-L1、CTLA-4等)水平，可將肝膽腫瘤免疫微環(huán)境分為4型，其中以高TMB、高炎癥細(xì)胞浸潤為特征的1型微環(huán)境腫瘤，對于免疫治療效果最佳，而以低TMB、缺乏炎癥細(xì)胞浸潤——“免疫荒漠”為特征的2型微環(huán)境腫瘤，對于免疫治療療效最差[48]。此外，肝膽腫瘤免疫治療中，我們還應(yīng)關(guān)注腫瘤免疫治療中超進(jìn)展的情況(hyperprogressive disease, HPD)。數(shù)據(jù)顯示，腫瘤免疫治療中HPD發(fā)生率在10%左右[49-50]，MDM2、MDM4、EGFR及11q13區(qū)間(包含CCND1、FGF19、FGF3、FGF4)基因擴(kuò)增可能與腫瘤免疫治療HPD相關(guān)[51]，肝膽腫瘤免疫治療HPD發(fā)生率、預(yù)測標(biāo)志物等還需要進(jìn)一步研究觀察。

本共識編撰指導(dǎo)專家(按姓氏拼音排名)：蔡建強(qiáng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院)，盧實(shí)春(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心)，秦叔逵(解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)，趙景民(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，張寧(北京大學(xué))，Xinwei Wang(美國國立衛(wèi)生研究院/國家腫瘤研究所)，Lewis Roberts(梅奧診所)

參與共識討論的專家(按姓氏拼音排名)：安文林(北京化工大學(xué))，白凡(北京大學(xué))，畢新宇(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院)，常東(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院)，陳剛(山西太原市第三人民醫(yī)院)，成軍(首都醫(yī)科大學(xué)附屬地壇醫(yī)院)，崔久嵬(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心)，陳敏山(廣州中山大學(xué)腫瘤防治中心)，陳志翱(復(fù)旦大學(xué)腫瘤研究所)，杜映榮(云南省昆明市第三人民醫(yī)院)，古槿(清華大學(xué)自動化系)，洪智賢(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，莢衛(wèi)東(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院)，賈曉東(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，匡銘(廣州中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院)，李海洋(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)，劉連新(中國科技大學(xué)附屬醫(yī)院)，魯志(清華大學(xué)生科院)，羅莉(貴州省貴航貴陽醫(yī)院)，郎韌(北京朝陽醫(yī)院)，劉秀峰(解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)，梁躍東(貴州省貴陽市公共衛(wèi)生救治中心)，劉振文(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，潘杰(北京協(xié)和醫(yī)院)，浦立勇(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，彭濤(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)，錢紅綱(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院)，孫斌(首都醫(yī)科大學(xué)附屬佑安醫(yī)院)，宋天強(qiáng)(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院)，蘇昕(北京化工大學(xué))，譚曉東(中國醫(yī)大盛京醫(yī)院)，王華(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)，王魯(復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院)，王立明(大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院)，王楠婭(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心)，王瓊(江陰市人民醫(yī)院腫瘤科)，吳向未(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)，汪小我(清華大學(xué)自動化系)，夏鋒(陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院)，薛瑞棟(北大醫(yī)院)，楊松(首都醫(yī)科大學(xué)附屬地壇醫(yī)院)，尹洪芳(北京清華長庚醫(yī)院)，虞朝輝(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)，云徑平(廣州中山大學(xué)腫瘤防治中心)，周光德(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，張佳林(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)，趙明(廣州中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院)，張寧(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，趙攀(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，張強(qiáng)(淄博市第四人民醫(yī)院腫瘤科),左石(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)，趙雪珂(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)，智緒亭(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院),曾義嵐(四川省成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心)，趙一鳴(復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)，曾珍(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，朱震宇(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)

執(zhí)筆專家：陸蔭英(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，趙海濤(北京協(xié)和醫(yī)院)，程家敏(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心)，姬峻芳(浙江大學(xué)生命科學(xué)院)