新輔助化療對晚期上皮性卵巢癌免疫微環(huán)境的影響研究進(jìn)展

董紹華 田翔宇 崔秀娟 王穩(wěn)

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是最致命的婦科惡性腫瘤，由于缺乏有效的早期篩查手段，發(fā)現(xiàn)時多已處于廣泛盆腹腔轉(zhuǎn)移的晚期，確診后5 年存活率僅為45%［1］。手術(shù)聯(lián)合鉑類為基礎(chǔ)的化療是EOC的主要治療方法，是否完全切除肉眼可見病灶是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素［2］。對于手術(shù)不能完全切除的FIGOⅢC期或Ⅳ期患者，新輔助化療加中間型腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)是可供選擇的替代治療方案［3］。盡管大多數(shù)卵巢癌患者對目前的治療方案（紫杉醇/鉑類化療）有效，仍有70%的患者最終會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和化療耐藥［4］。已有證據(jù)表明，宿主免疫系統(tǒng)在控制腫瘤生長方面起著重要作用，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）與提高EOC患者的生存率密切相關(guān)，TILs的出現(xiàn)成為目前腫瘤免疫治療的新策略［5］。本文將對TILs診斷和預(yù)后價值的最新進(jìn)展做一綜述，回顧新輔助化療對晚期EOC免疫微環(huán)境的影響，以期為將來免疫治療作為初始治療后的維持治療提供參考。

一、TILs治療原發(fā)性卵巢癌對預(yù)后的影響

1.TILs與卵巢癌預(yù)后

TILs在卵巢癌中的作用已被證實，研究表明宿主免疫系統(tǒng)與腫瘤之間存在相互作用［6］。TILs 主要包括CD3+T淋巴細(xì)胞（含CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個亞群）、B 淋巴細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，這些細(xì)胞穿過血管系統(tǒng)定位于腫瘤組織或其周圍的間質(zhì)，并參與腫瘤生長的控制［7］。多項研究證實了TLLs 在卵巢癌中的重要預(yù)后價值。Li J等最近的薈萃分析中，納入了21項不同的研究，涵蓋近3 000 名患者，發(fā)現(xiàn)上皮內(nèi)TILs 與卵巢癌患者的生存率有顯著的相關(guān)性［8］。多項獨立研究均證實了CD8+TILs 與卵巢癌患者的生存率顯著相關(guān)［9-11］。此 外，也 有 研 究 報 道 了CD4+ TILs［9，12］以 及CD3+TILs［13］的預(yù)后意義，但相關(guān)程度相對較低。

卵巢癌中是否存在其他免疫細(xì)胞發(fā)揮作用，其研究結(jié)果相互矛盾。在一項對49例高級別卵巢癌大網(wǎng)膜標(biāo)本以及59 例轉(zhuǎn)移性卵巢癌患者的研究中，CD19+B 細(xì)胞浸潤與較低的生存率相關(guān)［14-15］。與之相反，在一項納入199 例卵巢癌患者的研究中，CD20+B細(xì)胞與生存率提高有關(guān)［16］。另一項研究表明，與存在CD8+TILs單獨浸潤的患者相比，CD8+CD20+TILs患者具有更好的預(yù)后［11］。

2.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與卵巢癌預(yù)后

細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的招募和激活需要一系列緊密協(xié)調(diào)的相互作用，首先是與腫瘤抗原結(jié)合的HLA-I類分子，功能性抗原處理機制已被證明可以影響CD8+/CD3+TILs以及腫瘤浸潤和生存，HLA-DMB以及HLA-HC的下調(diào)使TILs水平降低，從而導(dǎo)致晚期卵巢癌患者的生存率降低［17］。CD4+ CD25+Foxp3+ 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T-cells，Tregs），具有通過TGF-B和IL-10等細(xì)胞因子抑制免疫細(xì)胞活性的能力，并在巨噬細(xì)胞等其他細(xì)胞中誘導(dǎo)免疫抑制表型。浸潤性卵巢癌組織中Tregs 水平更高，從而限制了抗腫瘤免疫活性并有利于腫瘤細(xì)胞的生長［18-19］。大多數(shù)研究證實腫瘤內(nèi)Tregs聚集與其病理分期和分級有關(guān)，Tregs 水平升高預(yù)示著更低的生存率，但也有研究認(rèn)為Tregs 可以改善患者的預(yù)后［20-21］。

3.TILs/Tregs與卵巢癌預(yù)后

事實上，卵巢癌細(xì)胞毒性和抑制性T 細(xì)胞之間的相互關(guān)系更能提供有價值的信息，例如，有研究證實了腫瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞/Tregs 以及CD8+CD4+T細(xì)胞/Tregs 比值增加，卵巢癌患者的總體生存率提高［22］。然而，現(xiàn)有的一些數(shù)據(jù)也與前述結(jié)果相矛盾，證實Tregs 可以改善預(yù)后［16］。盡管如此，目前流行的觀點是卵巢癌微環(huán)境中Tregs 的存在抑制了免疫系統(tǒng)殺傷癌細(xì)胞的能力［7］。

二、EOC新輔助化療的免疫調(diào)節(jié)作用

鑒于越來越多的晚期EOC 患者接受新輔助化療，目前大多研究通過對TILs亞群進(jìn)行定性和定量分析，評估新輔助化療后免疫參數(shù)的變化。最近一項涉及150 名患者（包括83 名NACT 治療前后配對患者）的研究，證實NACT 后間質(zhì)TILs 水平顯著升高，在多變量分析中，NACT 后間質(zhì)中高TILs 水平仍然是無進(jìn)展生存的預(yù)后因素。當(dāng)考慮個體患者時，NACT 的免疫調(diào)節(jié)作用是可變的，一定程度反映了EOC 的異質(zhì)性。超過一半的EOC 表現(xiàn)為間質(zhì)TILs 和/或上皮內(nèi)TILs 的募集，而1/4 的EOC 顯示TILs 減少，這表明NACT 可能對腫瘤微環(huán)境有刺激或抑制作用。同樣，NACT 對PD-L1 的表達(dá)有重要影響，NACT 前后PD-L1 的比例從30%顯著提高到53%［23］。

在其他研究中，新輔助化療后TILs的水平明顯增加。Polcher M 等研究分析了30 例晚期EOC 患者NACT 前后上皮內(nèi)TILs 水平的變化，結(jié)果表明，NACT 后CD4+（2.5 倍）、CD8+（2.5 倍）和顆粒酶B+（2.5 倍）細(xì)胞顯著增加，而Foxp3+細(xì)胞數(shù)量沒有變化，提示NACT 對活化T 細(xì)胞的募集或擴(kuò)增與Tregs的作用不同［21］。

在一個由26名配對患者（NACT 治療前后）組成的隊列研究中，NACT 后上皮內(nèi)TILs 的CD3+、CD8+、CD20+和PD-1+顯著增加，CD4+T 細(xì)胞密度有增加趨勢，而上皮內(nèi)Foxp3+和IDO-1+細(xì)胞在NACT 后無明顯變化。研究描述了NACT 的三種反應(yīng)模式，其中最初具有高免疫標(biāo)記物水平的腫瘤在NACT 后表現(xiàn)出更高的表達(dá)；具有初始低/中等水平，其增加模式與第一種類似；無TILs的腫瘤通常在NACT 后仍然保持陰性［21，24］。這些研究結(jié)果證實了NACT對腫瘤微環(huán)境的影響是可變的。

然而，關(guān)于新輔助化療導(dǎo)致TILs顯著升高的說法并不一致。在一項針對54 例HGSC 患者的研究中，Bohm S等分析了25例配對患者化療后T細(xì)胞密度的變化，NACT 前后CD8、CD4、CD3、CD45+TILs 密度均無顯著性差異，在NACT 治療后有良好療效的組別中，F(xiàn)oxp3+ TILs 明顯減少，PD-1、CTLA4和PD-L1等共調(diào)節(jié)分子表達(dá)增加。研究還證實，尤其是在對NACT 反應(yīng)良好的患者中，隨著CD4+T 細(xì)胞IFN 生成的增強，T 細(xì)胞活化增強，抗腫瘤Th1 基因的信號增強［25］。這些研究強調(diào)了NACT 對腫瘤免疫環(huán)境的重要影響，在選擇患者進(jìn)行免疫治療時，應(yīng)考慮治療后腫瘤的免疫狀況。

三、新輔助化療后TILs對預(yù)后的影響

評估NACT 后免疫亞群的研究均未發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+或CD3+ TILs 水平與預(yù)后的相關(guān)性［5，21，25］。對CD8+/CD4+ TILs 比值的研究顯示出矛盾的結(jié)果，Polcher 的研究證實可以改善預(yù)后，但Bohm S 的研究結(jié)論與之相反［21，25］。Wouters MC 等比較了晚期高級別漿液性癌（high-grade serous carcinoma，HGSC）患者（134例手術(shù)治療，121例新輔助化療）中TILs的浸潤情況，研究發(fā)現(xiàn)，CD8+TILs 是預(yù)示可行徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的唯一指標(biāo)，而CD27+CD8+TILs的患者，即使是不徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，預(yù)后也相對較好。在接受新輔助化療的患者中，NACT后CD8+以及CD27+細(xì)胞浸潤均與預(yù)后無明顯相關(guān)性［5］。

CD8+/CD4+/CD3+TILs 的患者新輔助化療后預(yù)后并沒有得到明顯改善，可能的原因在于協(xié)同抑制分子的共同上調(diào)［23-25］。研究表明，約2/3 PD-L1 陰性的TILs患者在NACT后PD-L1呈陽性，而化療后sTILs 水平的升高更多見于PD-L1 陽性的患者，證明這種免疫抑制機制的激活是化療期間對免疫刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)［23］。PD-1是表達(dá)于T細(xì)胞上的免疫抑制分子，它可以阻止T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，并可產(chǎn)生細(xì)胞因子［26］，其配體PD-L1上調(diào)后可引起T細(xì)胞凋亡［27］，使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸［28］。因此，PD-1、CTLA4 或其他協(xié)同調(diào)節(jié)分子同時增加免疫抑制信號，從而抵消了化療刺激T細(xì)胞募集的潛在有益效果［25］。

Foxp3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，是當(dāng)前鑒定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最常用的分子標(biāo)志物，而且參與了Tregs 細(xì)胞的分化和功能。NACT 后Foxp3+T 淋巴細(xì)胞減少的患者預(yù)后較好［21，25］。Polcher M 等證實了NACT 后顆粒酶B+T細(xì)胞顯著增加與PFS的改善有關(guān)［21］。顆粒酶B 是一種顆粒相關(guān)蛋白，表達(dá)于NK 細(xì)胞以及活化的CD8+CTLs細(xì)胞中，顆粒酶B+/Foxp3比值的增加與PFS 呈正相關(guān)［21］。雖有研究發(fā)現(xiàn)，NACT 后CD79+B 細(xì)胞、CD138+漿細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞表達(dá)無差異，且與預(yù)后無明顯相關(guān)性，但NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B 細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞水平在NACT前后的變化，其具體特征仍尚不清楚［24］。

迄今為止所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)大多基于使用不同新輔助化療方案、抗體、標(biāo)記物和截點的小型異質(zhì)性回顧性研究，上述因素可能是不同研究結(jié)果之間存在差異的原因，從而導(dǎo)致了明確卵巢癌化療后樣本中免疫亞群對預(yù)后的影響較為困難。此外，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化的方法來評估卵巢癌中TILs 水平，上皮內(nèi)/間質(zhì)/腫瘤內(nèi)/瘤體周圍TILs 之間的差異仍不十分明確［29］。相比之下，在乳腺癌中，國際TILs工作組已經(jīng)發(fā)布了一種推薦的評估方法，其中間質(zhì)TILs和上皮內(nèi)TILs 都被明確定義并作為獨立參數(shù)進(jìn)行評估［30］。其他對結(jié)果產(chǎn)生影響的因素還包括樣本固定方案、最后一個化療周期和樣本獲取之間的時間間隔、疾病分期和組織學(xué)等。如何更全面地評估原發(fā)性卵巢癌和多發(fā)性腹膜轉(zhuǎn)移瘤解剖上不同區(qū)域的免疫參數(shù)，對于闡明腫瘤異質(zhì)性如何導(dǎo)致化療前后免疫狀況的差異至關(guān)重要［29］。

盡管研究結(jié)果之間存在一些差異，但現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)支持，NACT 后殘留腫瘤中免疫細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的平衡與預(yù)后密切相關(guān)。例如，高水平細(xì)胞毒性TILs 與低水平Foxp3+ TILs 二者的結(jié)合，通常與患者的生存率提高有關(guān)［29］。未來將進(jìn)一步研究TILs各個亞群在免疫應(yīng)答中的作用機制，探索相關(guān)免疫參數(shù)在卵巢癌診斷和NACT后的預(yù)后價值。

四、NACT后的免疫治療策略

目前EOC的治療仍然是一個重大挑戰(zhàn)，迫切需要新的治療策略來降低晚期患者的高復(fù)發(fā)率和死亡率。整合有關(guān)卵巢癌NACT 局部免疫反應(yīng)的信息可獲得更有效和個性化的免疫治療策略。EOC中進(jìn)行的免疫治療試驗是在未經(jīng)選擇的、經(jīng)過大量預(yù)處理的潛在免疫衰竭患者中進(jìn)行的，結(jié)果只有適度的應(yīng)答率［31］。以導(dǎo)致復(fù)發(fā)的最小殘留病灶為目標(biāo)，利用宿主免疫系統(tǒng)對選定的患者進(jìn)行初始治療后的免疫維持治療，可能是更合適的治療方式［29］。

越來越多針對T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的各種協(xié)同調(diào)節(jié)分子（IDO、TIM3、LAG3、CCR2、CSF1R、GITR、OX40、ICOS）的免疫療法正在開發(fā)中［29］。未來的試驗應(yīng)更側(cè)重于評估個體化的免疫治療策略，根據(jù)NACT 后的腫瘤免疫狀況來選擇輔助治療［29］。例如，NACT 后腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞豐富、PD-L1陽性的患者，可給予PD-1/PD-L1 抑制劑作為維持治療；NACT 后淋巴細(xì)胞豐富、PD-L1 陰性患者，免疫治療可根據(jù)其他共抑制分子（TIM3、LAG3、IDO）或共刺激分子（OX40、GITR）的表達(dá)做出調(diào)整；治療后淋巴細(xì)胞缺乏、PD-L1陽性的患者可采用PD-1/PD-L1 抑制劑聯(lián)合疫苗或抗CTLA4 輔助治療，以增強內(nèi)源性TILs的運輸和活性，從而最大限度地提高治療效果［29］。

EOC是典型的化療敏感性腫瘤，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可以通過化療來消除。然而，真正完全的病理反應(yīng)＜5%，因此，NACT后幾乎均存在有活性的腫瘤組織。越來越多的研究證實，從接受新輔助化療的患者中獲取配對序列研究樣本是可行的［25，32-34］。然而，對化療后每隔一段時間取出的卵巢癌樣本進(jìn)行生物標(biāo)記分析是一個巨大的挑戰(zhàn)，這需要研究人員與外科醫(yī)生和病理學(xué)家密切合作，以優(yōu)化腫瘤樣本的選擇、處理和固定［29］。

評估NACT 對免疫相關(guān)基因譜的影響有助于對殘留腫物的免疫背景進(jìn)行更有效的解讀，將來可以在新輔助化療試驗中單獨研究，也可與新的靶向和免疫治療方案相結(jié)合。此外，為了加強免疫和細(xì)胞毒性療法之間的協(xié)同作用，新輔助化療方案需要進(jìn)一步優(yōu)化，確定所用藥物的最佳時機和順序至關(guān)重要。無論是卡鉑還是紫杉醇，均不能誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD），是否可以通過加入經(jīng)典的ICD誘導(dǎo)劑（如阿霉素或環(huán)磷酰胺）來增強新輔助化療的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，有望成為一種有前景的方法。

五、結(jié)語

卵巢癌中TILs 的聚集是影響生存的重要因素。目前已有研究表明，新輔助化療可通過增加CD8+T細(xì)胞、減少Tregs 和改變免疫共抑制分子如PD-L1或CTLA4的表達(dá)來破壞腫瘤的免疫微環(huán)境。將來需要在更大的人群中進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以明確NACT 后腫瘤床上發(fā)生的免疫變化?？紤]到腫瘤對NACT 的免疫反應(yīng)，在初次治療后，根據(jù)免疫亞群的類型和化療后腫瘤中確定的共調(diào)節(jié)分子的表達(dá)，將EOC患者的維持治療進(jìn)行分層管理，從而實現(xiàn)真正的個體化治療。NACT 后根據(jù)腫瘤免疫狀況，結(jié)合適當(dāng)?shù)木S持性個體化免疫治療藥物，可能消除微小殘留病灶，改善晚期卵巢癌患者的預(yù)后，有望成為新的有希望的治療方法。