心肌缺血再灌注損傷研究進(jìn)展

高啟軍，董曉帆，鄧長金

（湖北省荊門市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北荊門 448000）

提要：急性心肌梗死是主要的致死致殘?jiān)颍俟嘧⒅委熓瞧錁?biāo)準(zhǔn)的治療方案，然而再灌注治療伴隨著再灌注損傷，再灌注損傷的機(jī)理目前還未完全清楚，分子、細(xì)胞、組織上的改變均與參與再灌注損傷，本文就心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展作一綜述。

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，占總死亡率的三分之一，其中以急性心肌梗死最為嚴(yán)重［1］。每年有超過300 萬急性ST 段抬高型心肌梗死患者，對這類患者最有效的治療方法為及時、有效的再灌注治療［2］，再灌注治療改善心肌供血的同時伴隨著一系列病理生理反應(yīng)，包括過氧化反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最后出現(xiàn)不可逆的細(xì)胞凋亡和壞死，這種因再灌注損傷所致的心肌損傷稱為再灌注損傷［3］。

再灌注損傷與分子、細(xì)胞、組織上的改變?nèi)缂?xì)胞死亡、炎癥、中性細(xì)胞活化和氧化應(yīng)激等有關(guān)［4］。再灌注損傷評估與治療仍然是臨床難題，具體機(jī)理目前尚不明確，仍然是研究的熱點(diǎn)之一。本文對再灌注損傷的機(jī)理最新進(jìn)展作一綜述。

1 鈣超載及鈣蛋白酶與缺血再灌注損傷

鈣離子是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，參與維持細(xì)胞生理功能，正常情況下，細(xì)胞外鈣離子濃度是細(xì)胞內(nèi)的近萬倍。目前認(rèn)為鈣超載的原因主要有：（1）心肌缺血致心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子順濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；（2）正常生理情況下，鈣泵將細(xì)胞內(nèi)多余的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，保持細(xì)胞內(nèi)合理的鈣濃度。當(dāng)心肌缺血時，三磷酸腺苷生成減少或缺乏，使鈣泵失活，不能及時泵出細(xì)胞內(nèi)的鈣；（3）缺血時缺血區(qū)因無氧酵解產(chǎn)生大量的乳酸、丙酮酸等致pH 值下降，當(dāng)再灌注后氧氣進(jìn)入缺血區(qū)，乳酸、丙酮酸可進(jìn)一步代謝，一部分乳酸、丙酮酸隨血流進(jìn)入體循環(huán)代謝，細(xì)胞外pH 值逐漸恢復(fù)，而細(xì)胞內(nèi)恢復(fù)較慢，細(xì)胞內(nèi)外形成pH 值梯度，細(xì)胞內(nèi)的H+向外移動，為達(dá)到電平衡致Na+內(nèi)流［5］。再灌注后能量供應(yīng)和pH 值的恢復(fù)，開始Na+-Ca2+交換，細(xì)胞外的Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。研究表明，鈣超載后可通過各種途徑引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體膜電位異常、促進(jìn)凋亡因子釋放等引起心肌細(xì)胞死亡。除此之外，鈣超載可激活鈣蛋白酶calpain 引起再灌注損傷。在生理情況下，calpain 與鈣蛋白酶抑素calpastatin一起儲存在細(xì)胞質(zhì)中，為非活性狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升是鐵蛋白酶激活的關(guān)鍵因素［3］。近年來，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，calpain 可引起心肌缺血再灌注損傷，而calpain 抑制劑對缺血再灌注心肌有保護(hù)作用［6］。但calpain 參與缺血再灌注損傷的機(jī)制目前還不清楚，考慮可能與calpain 裂解凋亡相關(guān)的酶有關(guān)，如caspase-3、Bax 等。

2 超氧化物與缺血再灌注損傷

生理情況下體內(nèi)生成少量氧自由基可以很快被清除。當(dāng)氧自由基生成過多過快或消除減少，就可能出現(xiàn)氧自由基聚集，在細(xì)胞缺血缺氧時，細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，氧自由基清除能力不足，當(dāng)缺血組織突然恢復(fù)供應(yīng)血液時，產(chǎn)生大量氧自由基，不能及時被清除，對自身和周圍細(xì)胞造成傷害，從而引起心肌損傷。

缺血再灌注的前數(shù)分鐘，特別是開始再灌注時，能經(jīng)過多種途徑產(chǎn)生大量活性氧［7］。Arroyo 等［8］用同位素方法證實(shí)心肌缺血及其后的再灌注過程中有活性氧的形成，之后臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗氧自由基治療具有心肌保護(hù)作用［9］。隨后的研究表明，經(jīng)超氧化物歧化酶處理的動物或細(xì)胞質(zhì)、線粒體超氧化物歧化酶相關(guān)基因被過度表達(dá)的動物所發(fā)生的缺血再灌注損傷較少，這些都證實(shí)超氧化物的毒性作用［10］。超氧化物本身在體內(nèi)造成的細(xì)胞毒性作用不大，因?yàn)檫@個激進(jìn)物質(zhì)可快速、自發(fā)歧化為過氧化氫（H2O2），在超氧化物歧化酶作用下這種轉(zhuǎn)化可加速約10 000 倍，這種快速轉(zhuǎn)換有效地防止了O2-與其他生物分子在細(xì)胞中的反應(yīng)，除非O2-的產(chǎn)生與潛在的反應(yīng)物非常接近。從超氧化物歧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2在高濃度時具有細(xì)胞毒性，也可以通過鐵或銅催化的反應(yīng)來刺激高活性羥基自由基（HO·）的產(chǎn)生。此外，超氧化物可以轉(zhuǎn)化為另一個高活性的物質(zhì)——超氧化氫（HOO-）。超氧化物細(xì)胞毒性也可以由其與一氧化氮結(jié)合生成過毒性更大的亞硝酸根（ONOO-）和其他破壞性RNOS。過亞硝酸根可以質(zhì)子形成過氧亞硝基酸（ONOOH），本身是一種強(qiáng)細(xì)胞毒性氧化劑。最后，超氧化物可以氧化滅活多種酶，特別是含有鐵硫中心的酶，如烏頭、延胡索酸酶、NADH 脫氫酶、肌酸激酶和磷酸神經(jīng)鈣蛋白等［11］。自由基產(chǎn)生后還可損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜失去正常的屏障功能，通透性增加，使細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)可以順濃度流動，最后使細(xì)胞失去正常功能；自由基可通過氧化破壞機(jī)體蛋白，改變蛋白酶表面結(jié)構(gòu)而使其失去功能。自由基可使遺傳物質(zhì)DNA、RNA 斷裂，使核酸失去正常功能，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］。

3 線粒體與缺血再灌注損傷

線粒體在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，占細(xì)胞質(zhì)容量的30%～50%，是細(xì)胞的能量工廠，機(jī)體95%的能量是通過線粒體氧化、磷酸化產(chǎn)生。線粒體是活性氧的主要產(chǎn)生部分，也是最易受活性氧傷害的部位。線粒體損傷表現(xiàn)為線粒體結(jié)構(gòu)改變，功能喪失，數(shù)量減少，最后出現(xiàn)能量供應(yīng)不足，心肌細(xì)胞失去收縮功能，最后出現(xiàn)心肌細(xì)胞死亡。在這些變化中，發(fā)揮重要作用的是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）。MPTP 是位于線粒體內(nèi)外膜上的一種非特異性通道，相對分子質(zhì)量≤1 500 的物質(zhì)可以通過MPTP，開放后可以使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電化學(xué)質(zhì)子梯度消失，呼吸鏈電子不能傳遞，氧化磷酸化解耦聯(lián)，細(xì)胞生成三磷酸腺苷障礙，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成。此外，由于線粒體基質(zhì)中一些大分子蛋白質(zhì)不能通過MPTP，基質(zhì)內(nèi)滲透壓相對較高，離子、水等物質(zhì)非選擇性地進(jìn)入基質(zhì)，使線粒體水腫，外膜破裂，促使凋亡物質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、核酸內(nèi)切酶G 等從膜間隙進(jìn)入胞質(zhì)中，引起細(xì)胞凋亡。

在缺血再灌過程中，各種生理、生化的原因可導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放。在缺血階段，鈣離子、長鏈脂肪酸和活性氧累積使MPTP 易于打開［13］，而因?yàn)槿毖?，無氧酵解增加產(chǎn)生大量乳酸，使局部血pH 值下降抑制MPTP 開放。當(dāng)再灌注發(fā)生后，線粒體恢復(fù)呼吸功能，開始修復(fù)跨膜電位，pH 值逐漸恢復(fù)正常；當(dāng)呼吸鏈重新獲得氧氣會產(chǎn)生大量的活性氧，加上鈣超載等共同促進(jìn)MPTP開放［13］。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)在缺血階段MPTP 是關(guān)閉的，再灌注過程中開放，目前缺血再灌注研究己將MPTP 作為心臟保護(hù)的新靶點(diǎn)［14］。

4 基質(zhì)金屬蛋白酶與缺血再灌注損傷

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組含鋅離子的鈣依賴細(xì)胞外間質(zhì)水解酶，研究表明，其參與了機(jī)體多種生理和病理過程，包括缺血再灌注損傷。在大鼠離體心臟缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)再灌注時MMP-2 釋放明顯增加，心功能差的大鼠MMP-2 的釋放量更大；用含MMP-2 的灌流液灌流，可使缺血再灌注心肌心功能下降，而用含MMP-2 特異性抑制劑菲洛林或抗體的灌流液灌注，可使缺血再灌注心肌心功能好轉(zhuǎn)［15］。一氧化氮的產(chǎn)物過氧亞硝酸鹽（0N00-）可促進(jìn)MMP-2 的釋放，并使心功能下降，提示自由基對缺血再灌注心肌的損傷與激活MMPs 有一定關(guān)系［16］。

5 細(xì)胞凋亡

缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制是多因素性的，凋亡是再灌注損傷的主要致病機(jī)制之一，包括外部（或死亡受體）和內(nèi)在（線粒體）途徑，但他們之間有多種生物化學(xué)和功能聯(lián)系。外部或死亡受體通路涉及結(jié)合Fas，TRAIL 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等配體到促炎受體上，形成聚合物，促進(jìn)死亡領(lǐng)域的適配器蛋白（如FADD 和TRADD）的聚集，完成死亡誘導(dǎo)的信號復(fù)合體。一旦組裝，這個受體復(fù)合體激活caspase-8，最后激活caspase-3 水解許多細(xì)胞蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。如受到氧化應(yīng)激等細(xì)胞毒性刺激，其內(nèi)部途徑被激活。通過Bcl2 蛋白家族成員調(diào)節(jié)促進(jìn)調(diào)亡，使細(xì)胞膜通性增加，細(xì)胞色素C 等外滲，最后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 基因家族，其產(chǎn)物根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、功能不同分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白。其中Bcl-2 和bax的相互作用在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起重要作用［18］。

6 微小RNAs 與缺血再灌注損傷

微小RNA（microRNA，mRNA）由19-25 核苷酸組成單鏈小分子RNA，因?yàn)樘?，不能編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)，然而，他們通過抑制mRNA 的翻譯或誘導(dǎo)mRNA 降解來干預(yù)基因表達(dá)，最后參與缺血再灌注損傷［19］。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，mRNAs 也可以分泌到胞外間隔，如核糖體RNA。這些胞外RNA 作為損傷相關(guān)的分子和輔助因子激活炎癥和血栓形成［20］。缺血誘導(dǎo)的mRNA 特征為表達(dá)差異很大，與缺血的持續(xù)時間、細(xì)胞類型以及研究的時間點(diǎn)有關(guān)。最近的研究表明，在缺血再灌注過程中，細(xì)胞存活和凋亡中關(guān)鍵分子，如Bcl-2、FasL、HSP20、HSP60、HSP70、Mcl-1、Pdcd4、PI3K 和SIRT-1 的表達(dá)被mRNA 調(diào)控，目前正在研究阻斷mRNA 功能的方法。

7 內(nèi)皮細(xì)胞與缺血再灌注損傷

血管壁內(nèi)皮細(xì)胞占心肌體積的3%～5%，在正常的心臟生理和心臟對損傷的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［21］。血管內(nèi)皮層由內(nèi)皮細(xì)胞相互連接形成，為血管內(nèi)膜屏障，防止白細(xì)胞黏附和血小板聚集，降低炎癥反應(yīng)，有利于血管內(nèi)的血液正常流動。除此之外，內(nèi)皮細(xì)胞還可作為分泌細(xì)胞，分泌血管活性物質(zhì)，如分泌內(nèi)皮素、血管緊張素等血管收縮因子和一氧化氮、內(nèi)皮依賴性超極化因子（EDHF）等血管舒張因子。生理情況下，血管平滑肌的緊張度及血壓，血流的調(diào)控都由這些血管活性因子共同調(diào)節(jié)，維護(hù)機(jī)體血壓及內(nèi)環(huán)境的平衡。在缺血再灌注等病理情況可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，損害其分泌功能，調(diào)節(jié)功能失常致內(nèi)環(huán)境失調(diào)。缺血再灌注破壞內(nèi)皮屏障功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞吸附，擾亂內(nèi)皮依賴性血管舒張，并控制內(nèi)皮止血機(jī)制［22］。在缺血再灌注期間釋放出各種促炎介質(zhì)包括ROS、趨化因子、細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1）等，這些介質(zhì)激活細(xì)胞信號機(jī)制，引起交叉因子的磷酸化，解除它們與骨架元素的聯(lián)系，最終結(jié)果是細(xì)胞間連系被打斷，毛細(xì)血管通透性增加［23］。此外，缺血再灌注誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹致毛細(xì)血管腔的狹窄，這有助于在這些小血管內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞的聚集，最后發(fā)展為缺血后無回流。

本文探討了缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，研究表明缺血再灌注損傷涉及面廣，機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全研究清楚，目前考慮主要與超氧化物損傷、鈣超載、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞mRNA 及MMPs 等有關(guān)。