青光眼藥物跨角膜輸運(yùn)數(shù)學(xué)模型及特性分析

黃飛，徐洪濤，雷苑，屈治國

1.上海理工大學(xué)能源與動力工程學(xué)院，上海200093；2.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，上海200031；3.西安交通大學(xué)能源與動力工程學(xué)院，陜西西安710049

前言

青光眼是導(dǎo)致人類失明的三大致盲眼病之一，對青光眼的治療最普遍的一種治療方法是局部用藥。局部用藥是通過滴注眼藥水或涂抹眼藥膏等方法將藥物施于眼表層，藥物透過角膜進(jìn)入眼球前房區(qū)域，對前房區(qū)域內(nèi)病變組織進(jìn)行作用［1-2］，具有低滲透特性的角膜組織是藥物從眼表進(jìn)入前房最主要的屏障。此外，結(jié)膜和鞏膜的吸收作用也會使得藥物進(jìn)入體循環(huán)，藥物毒性會對全身造成不利影響［3-5］。因此，為使藥物能夠在盡可能短的時間內(nèi)進(jìn)入前房達(dá)到用藥劑量并減少對全身的毒副作用，亟需展開對青光眼局部用藥后藥物跨角膜輸運(yùn)特性的研究。

針對藥物跨角膜輸運(yùn)這一過程可以建立遵循特定物理規(guī)律的數(shù)學(xué)模型。首先需要了解藥物跨角膜輸運(yùn)過程的主要機(jī)理和影響因素，忽略次要因素，得到簡化的數(shù)學(xué)模型。對于輸運(yùn)特性問題的主要研究方法有實驗研究和借助數(shù)學(xué)模型研究。對眼藥制劑滲透角膜的實驗研究已有很多，但主要集中在不同藥物制劑的理化性質(zhì)對滲透效果的影響。張湘暉等［6］對新目安眼用凝膠劑等4種不同化學(xué)成分眼藥制劑進(jìn)行離體角膜滲透性試驗，取藥物跨角膜累積滲透最大量70%所需要的時間作為角膜滲透速度參數(shù)，得出新目安眼用凝膠制劑角膜滲透速度是目安眼用凝膠制劑的3.452倍。趙雯等［7］以離體角膜擴(kuò)散實驗研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3種環(huán)糊精對姜黃素角膜滲透性的影響，得出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3種環(huán)糊精作用下姜黃素的表觀滲透系數(shù)。以上研究并未能建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型用以藥物跨角膜輸運(yùn)更廣泛的研究。對于眼部建模仿真的研究進(jìn)展國內(nèi)已有趙亞麗等［8］進(jìn)行，得出人眼建模仿真的研究深化了對眼部生理學(xué)和病理學(xué)的認(rèn)識，總結(jié)了人眼建模仿真的重要發(fā)展趨勢。借助數(shù)學(xué)模型進(jìn)行藥物跨角膜輸運(yùn)特性的研究也已展開，例如，在藥物代謝動力學(xué)領(lǐng)域，早期的單室模型和多室模型已被廣泛用于研究藥物輸運(yùn)；Zhang等［9］和Edward等［10］提出了一種類磚模型，對藥物跨角膜輸運(yùn)過程與機(jī)理進(jìn)行了研究；Pak等［11］利用一種準(zhǔn)三維的計算生物學(xué)方法研究了藥物的跨角膜輸運(yùn)。單純的模型建立在沒有實驗相結(jié)合的情況下略顯單薄。進(jìn)行實驗與數(shù)學(xué)模型相結(jié)合的研究還不是很多，Gupta等［12］借助實驗擬合出一種藥物輸運(yùn)的控制方程，對角膜的非均質(zhì)性做了研究，包括了藥物-細(xì)胞結(jié)合分布動力學(xué)，角膜組織交界界面對輸運(yùn)的抗性和細(xì)胞內(nèi)的輸運(yùn)動力學(xué)。然而以上研究未能充分分析不同給藥方式對藥物進(jìn)入眼球前房通量以及累積量的影響。

因此，本文基于前期的青光眼藥物跨角膜輸運(yùn)實驗，修正基于菲克第二定律的藥物輸運(yùn)數(shù)學(xué)模型，分析了表面藥物濃度、擴(kuò)散系數(shù)、給藥方式對藥物累積的影響，以期為后續(xù)更加深入地研究藥物跨角膜輸運(yùn)機(jī)理提供理論指導(dǎo)。

1 青光眼藥物跨角膜輸運(yùn)實驗簡介

1.1 實驗方法及原理

考慮到采取活體實驗會受到眼內(nèi)房水流動等對藥物清除作用的影響，使得實驗難以獲取藥物跨過角膜的累積量，因此本文采取離體實驗的方法。本實驗選取最經(jīng)典，至今有140多年歷史且應(yīng)用廣泛的毛果蕓香堿作為研究跨角膜輸運(yùn)特性的實驗藥物，角膜選取厚度0.2 cm的新鮮豬角膜。

實驗采用Franz擴(kuò)散池對豬角膜進(jìn)行毛果蕓香堿水溶液的藥物滲透角膜離體實驗。在擴(kuò)散池的供給池部分中加入預(yù)先配置好的毛果蕓香堿水溶液，為減少實驗誤差，對比不同給藥濃度下藥物跨角膜輸運(yùn)特性，實驗分別配制了1%、5%［質(zhì)量分?jǐn)?shù)為ω=0.01（1×104μg/mL），ω=0.05（5×104μg/mL）］兩種濃度的毛果蕓香堿水溶液作為實驗藥物試劑。在接收池中精準(zhǔn)加入19 mL的PBS溶液（磷酸二氫鉀KH2PO4）作為接收液，并保證接收液與角膜間完全接觸無氣泡。

為減少實驗誤差，實驗中ω=0.01質(zhì)量分?jǐn)?shù)藥物制劑進(jìn)行3組實驗，如圖1中第1、2、3組實驗；ω=0.05質(zhì)量分?jǐn)?shù)藥物制劑進(jìn)行2組實驗，如圖1中第4、5組實驗。每組實驗加入的毛果蕓香堿水溶液為300 μL。

如圖1 所示，所有實驗用Franz 擴(kuò)散池置于透皮試驗儀內(nèi)進(jìn)行水浴加熱，溫度維持在37°C。在透皮試驗儀的作用下保持接收池內(nèi)藥物的均勻分布。在實驗非采樣期間為減小蒸發(fā)給實驗帶來的誤差，供給池與接收池的開口用密封條封住。

圖1 透皮試驗儀Fig.1 Transdermal device

分別在給藥的5、10、30、60、90、120、180、240 min后抽取接收液4 mL 置于取樣瓶中，每次抽取后向接收池補(bǔ)充4 mL的PBS溶液。對不同時間點接收池內(nèi)藥物濃度的測量通過高效液相色譜法測量得出，本高效液相色譜法參考陳濱等［13］實驗過程完成。

1.2 實驗結(jié)果

參考陳濱等［13］實驗過程，本文得到毛果蕓香堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（y）與濃度（x）（μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為式（1）：

通過對5 組實驗不同時間點下采集的接收池內(nèi)樣本溶液峰面積的獲取和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的計算可得到相應(yīng)時間點下接收池內(nèi)毛果蕓香堿的藥物濃度，分別對第1、2、3 組和第4、5 組同時間點取樣的藥物濃度結(jié)果求平均值，并將得出的平均值除以角膜面積，得到單位面積下的藥物濃度結(jié)果值，后文中的藥物濃度及累積量均對應(yīng)單位面積情況。

根據(jù)藥物在接收池內(nèi)的濃度及每次采樣量，利用式（2）計算藥物在不同時間內(nèi)透過單位面積角膜在其另一側(cè)的藥物累積量：

其中，Cn表示t時間點測得的接收池內(nèi)藥物濃度，μg/mL；Ci表示t時間點前一時間點測得的藥物濃度，μg/mL；V0表示接收池中內(nèi)溶液的總體積，19 mL；V表示每次的取樣體積，4 mL。其計算結(jié)果見表1。

表1 藥物累積量隨時間變化實驗數(shù)據(jù)表Tab.1 Experimental data of drug accumulation over time

根據(jù)實驗結(jié)果，參考Xu等［14］對藥物透皮擴(kuò)散階段的研究，可以得出藥物累積過程分3個部分，取ω=0.05實驗組的藥物累積量變化曲線進(jìn)行過程分析，分析圖解如圖2所示。圖2是根據(jù)實驗結(jié)果擬合出的曲線，曲線共分3個部分：第一部分稱為非穩(wěn)態(tài)階段，此階段藥物在角膜內(nèi)的分配未達(dá)到平衡；第二部分稱為偽穩(wěn)態(tài)階段，該階段內(nèi)藥物在角膜內(nèi)的分配達(dá)到平衡，藥物累積過程成線性增長，為對比與其他兩個部分的不同，特將第二部分的曲線兩段延長，如圖中黑色直線所示；第三部分階段的藥物累積速率變慢，造成這一結(jié)果的主要原因是隨著滲透時間的增加供給池內(nèi)藥物減少，藥物已經(jīng)無法完全覆蓋角膜，藥物供給不足。

圖2 藥物累積量曲線分析圖Fig.2 Curve analysis of drug accumulation

根據(jù)Xu等［14］在進(jìn)行藥物透皮擴(kuò)散研究時采用的時滯方法分析，可以計算出毛果蕓香堿水溶液跨角膜輸運(yùn)過程中的擴(kuò)散系數(shù)大小約為2.47×10-6cm2/s。

2 數(shù)學(xué)模型

2.1 藥物跨角膜輸運(yùn)數(shù)學(xué)模型

藥物分子在角膜組織中的輸運(yùn)是一個包含多種生命活動的極其復(fù)雜的一個過程。圖3 將角膜簡化為一個三層區(qū)域的多層結(jié)構(gòu)，把藥物跨角膜輸運(yùn)視為藥物在一個三層結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)的擴(kuò)散過程。該簡化符合角膜的生物學(xué)組織組成特征，對藥物輸運(yùn)規(guī)律的研究不會產(chǎn)生嚴(yán)重影響，且可以提供理論分析指導(dǎo)。局部給藥后，藥物從眼表淚膜開始向眼內(nèi)擴(kuò)散，經(jīng)過角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮直到穿透角膜，到達(dá)前房并在前房內(nèi)累積。

圖3 藥物輸運(yùn)示意圖Fig.3 Schematic of drug delivery

為了建立藥物跨過角膜組織以及藥物到達(dá)前房進(jìn)行累積的輸運(yùn)過程的基本微分方程，引入了以下假設(shè)：（1）局部給藥后，存留在淚膜上的藥物充足，且在眼表淚膜處的藥物濃度分布均勻，不受重力、溫度等外界環(huán)境因素影響，忽略結(jié)膜、鞏膜對藥物的吸收，眼表淚膜處藥物濃度保持恒定值C0；（2）初始階段，角膜及前房內(nèi)藥物濃度為0；（3）藥物在角膜各層組織內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)為恒定值；（4）藥物透過角膜進(jìn)入前房滿足“漏槽效應(yīng)”［14］，即，藥物進(jìn)入前房后會迅速被房水帶走，角膜內(nèi)皮與房水接觸位置上不存在藥物滯留，即角膜內(nèi)皮最內(nèi)側(cè)位置的藥物濃度始終保持為0；（5）藥物擴(kuò)散只有從眼外擴(kuò)散到眼內(nèi)一個方向，所以是一維的。

基于菲克第二定律，描述藥物在角膜組織內(nèi)的瞬時擴(kuò)散過程偏微分方程為：

式中，Ci是藥物濃度，Di是擴(kuò)散系數(shù)，下標(biāo)i=1,2,3分別代表角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮。在每層角膜交界處，兩側(cè)通量相等，即：

式中，下標(biāo)12、23 分別代表角膜上皮和基質(zhì)，基質(zhì)和內(nèi)皮不同層之間的交界面。

擴(kuò)散通量J由菲克第一定律進(jìn)行計算：

根據(jù)上述假設(shè)，可得到數(shù)學(xué)模型的初始與邊界條件如下：

初始條件：

邊界條件：

由于角膜被分成3層，角膜的上皮、基質(zhì)、內(nèi)皮分別對應(yīng)著3 個擴(kuò)散系數(shù)D1、D2和D3，因此角膜整體的等效擴(kuò)散系數(shù)Dcor可表示為：

其中，l、x1、x2、x3分別表示角膜整體厚度，上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮厚度。

利用等效擴(kuò)散系數(shù)，藥物通過整個角膜的等效擴(kuò)散方程為：

基于上述初始條件和邊界條件，式（10）中的藥物濃度分布解析解為：

根據(jù)菲克第一定律，將式（11）代入式（5），可計算藥物在角膜內(nèi)皮與房水交界處的藥物輸運(yùn)通量為：

將式（12）對時間積分，得到藥物通過單位面積角膜進(jìn)入前房的累積量：

將式（12）代入式（13）后可得藥物隨時間改變在前房內(nèi)的累積量數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

2.2 數(shù)學(xué)模型修正

根據(jù)第一節(jié)中的實驗已知毛果蕓香堿水溶液跨角膜輸運(yùn)的擴(kuò)散系數(shù)（Dcor=2.47×10-6cm2/s）以及角膜厚度（l=0.2 cm）。圖2表現(xiàn)的藥物累積量擬合曲線前兩個階段是滿足式（14）的變化規(guī)律，因此根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，修正式（14）中的參數(shù)，即可得出與實驗結(jié)果匹配良好的數(shù)學(xué)模型，模型計算結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)對比如圖4 和圖5 所示。結(jié)合式（14）與式（10）的關(guān)系可以得到毛果蕓香堿水溶液跨角膜輸運(yùn)的數(shù)學(xué)模型為式（15）：

其中，a表示角膜厚度修正參數(shù)；b表示擴(kuò)散系數(shù)修正參數(shù)。針對毛果蕓香堿水溶液，根據(jù)實驗結(jié)果擬合得到參數(shù)a=0.9，b=0.64。

圖4 數(shù)學(xué)模型與ω=0.01實驗組結(jié)果對比圖Fig.4 Comparison of mathematical model and experimental results of ω=0.01

圖5 數(shù)學(xué)模型與ω=0.05實驗組結(jié)果對比圖Fig.5 Comparison of mathematical model and experimental results of ω=0.05

如圖4和圖5所示，分別是在給藥濃度為1×104μg/mL與5×104μg/mL，擴(kuò)散系數(shù)Dcor=2.47×10-6cm2/s，角膜厚度l=0.2 cm的條件下，實驗結(jié)果與數(shù)學(xué)模型計算得出的藥物累積量—時間關(guān)系曲線對比圖。圖中藍(lán)色曲線是數(shù)學(xué)模型計算結(jié)果，紅色點是實驗結(jié)果數(shù)據(jù)。

3 藥物跨角膜輸運(yùn)特性分析

局部用藥的最終目的是使藥物能夠跨過角膜進(jìn)入前房區(qū)域，從而作用于前房區(qū)域內(nèi)的病變組織。基于以上修正的數(shù)學(xué)模型，圖6給出了相同的眼表給藥藥物濃度（C0=5×104μg/mL），不同擴(kuò)散系數(shù)（其中1倍的D=Dcor=2.47×10-6cm2/s，在后文中為方便分析，D即代表Dcor）影響下藥物在前房內(nèi)的累積量變化規(guī)律。圖7 給出了相同擴(kuò)散系數(shù)（D=2.47×10-6cm2/s），不同表面藥物濃度（其中1 倍的C0=5×104μg/mL）影響下藥物在前房內(nèi)的累積量變化規(guī)律。

圖6 藥物累積量隨擴(kuò)散系數(shù)變化曲線圖Fig.6 Graph of drug accumulation with diffusion coefficient

圖7 藥物累積量隨藥物初始濃度變化曲線圖Fig.7 Graph of drug accumulation with initial drug concentration

由圖6 可知，在表面藥物濃度恒定時，對比0.5D與4D兩種情況，藥物累積量在60 min后分別為42和4 798 μg，相差10 倍以上，在200 min 時分別為1 233和19 551 μg，相差約15 倍。對比0.5D與4D兩種情況，藥物累積量在30 min 時雖然在圖片中難以辨別差距，通過查閱相對應(yīng)的計算數(shù)據(jù)可知兩者相差1 000 倍以上，造成如此大差距的原因是30 min 時0.5D組的藥物還處在非穩(wěn)態(tài)階段，即藥物累積緩慢增長，沒有進(jìn)入線性增長的偽穩(wěn)態(tài)階段，藥物累積速度較慢。因此可以得出擴(kuò)散系數(shù)的提高可以明顯縮短藥物輸運(yùn)從非穩(wěn)態(tài)到偽穩(wěn)態(tài)階段的時間，提高相同時間內(nèi)藥物跨角膜輸運(yùn)的累積量。

對比圖7 中0.5C0與4C0兩種情況，在當(dāng)量擴(kuò)散系數(shù)不變的情況下，藥物累積量在30、60、200 min 相差均為8 倍，與初始給藥濃度無關(guān)。因此，綜合考慮高藥物濃度可能對角膜及全身（結(jié)膜及鞏膜會吸收藥物進(jìn)入體循環(huán)）帶來的藥物毒性，提高擴(kuò)散系數(shù)是藥物設(shè)計中重要的研究方向。

以上對藥物輸運(yùn)特性的分析是基于角膜外表面給藥濃度不發(fā)生變化的理想情況進(jìn)行的，而在實際給藥過程中，藥物會受到給藥形式的影響。除了以上提到的一種藥物濃度不變的給藥方式外，本文還將根據(jù)實際給藥情況對比分析另外兩種不同的眼表給藥方式。第二種給藥方式是以眼藥膏形式給藥（例如以熱固凝膠為藥物載體的情況［15］），在這種情況下眼表藥物濃度半衰期為1 818 s［16］，因此角膜外表面藥物濃度Ccor隨時間變化的函數(shù)關(guān)系如方程（16）［17］：

其中，C0是Ccor的初始濃度，α=-0.000 38。

第三種給藥方式是以眼藥水的形式給藥，且此時受到淚液對藥物的清除作用。這種情況下眼表藥物濃度則有更短的半衰期177.7 s［16-18］，因此角膜外表面藥物濃度Ccor隨時間的函數(shù)關(guān)系同式（16），其中α=-0.003 9。在式（16）中，指數(shù)函數(shù)的時間參數(shù)α是由ln(2)除以相應(yīng)的半衰期計算得到的［17］。對于第一種給藥方式則α=0。在C0=5×104μg/mL，D=2.47×10-6cm2/s的條件下，3 種不同的給藥方式下藥物經(jīng)角膜進(jìn)入前房的藥物輸運(yùn)通量隨時間變化曲線如圖8所示。

圖8 藥物通量隨時間變化曲線圖Fig.8 Graph of drug flux over time

圖8中綠線表示第一種給藥方式，即角膜外表面藥物濃度為恒定常數(shù)C0，這是一種理想條件?？梢姷谝环N方式藥物通量會先增加再趨于一個穩(wěn)定值，約0.45 μg/(cm2?s)。紅線表示第二種給藥方式，即角膜表面施用眼藥膏，藍(lán)線表示第三種給藥方式，即在角膜表面施用眼藥水且受到淚液的清除作用。與第一種給藥方式不同，第二種給藥方式下藥物通量會先升高到一個峰值而后下降，最后趨向于0，而第三種給藥方式下藥物通量變化規(guī)律相同，隨著時間推移也將會趨向于0。造成與第一種給藥方式下不同的藥物通量變化規(guī)律的原因是眼表藥物濃度變化規(guī)律不同，在第二和第三種給藥方式下眼表濃度會不斷下降，而第一種給藥方式是保持眼表濃度不變。在第二種給藥方式下藥物通量會在約60 min到達(dá)峰值0.17 μg/(cm2?s)，在第三種給藥方式下藥物通量會在約35 min 到達(dá)峰值0.03 μg/(cm2?s)。隨著時間推移，后兩種給藥方式下眼表藥物濃度都將向0衰減，這也導(dǎo)致了藥物通量最后趨向于0。造成兩者峰值及到達(dá)峰值時間不同的原因是藥物在眼表濃度的衰減時間不同，淚液的清除作用下，大部分以水溶液形式的藥物很快從角膜表面清除，而以藥膏形式的藥物不會被淚液迅速清除而在角膜表面停留一段時間，藥物可以緩慢持續(xù)釋放進(jìn)入眼內(nèi)。

由于不同給藥方式使得藥物進(jìn)入前房的藥物通量變化不同，藥物在前房區(qū)域的累積也有所不同，如圖9所示。從圖中可以看出，理想狀態(tài)下的第一種給藥方式會使前房內(nèi)藥物累積量持續(xù)升高，第二和第三種給藥方式下藥物累積量增長到一定數(shù)值后會緩慢趨于平穩(wěn)。

圖9 不同給藥方式下藥物累積量變化曲線圖Fig.9 Graph of drug accumulation with different administration modes

4 結(jié)論

通過對兩種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)青光眼藥物毛果蕓香堿水溶液對角膜的離體滲透實驗，將藥物跨角膜輸運(yùn)過程分成了非穩(wěn)態(tài)和偽穩(wěn)態(tài)兩個階段。首先，根據(jù)實驗結(jié)果修正了藥物跨角膜輸運(yùn)數(shù)學(xué)模型。其次，通過對修正的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行理論分析，得出了擴(kuò)散系數(shù)的提高不僅可以縮短藥物輸運(yùn)從非穩(wěn)態(tài)到偽穩(wěn)態(tài)階段的時間，也可以有效提高相同時間內(nèi)的藥物累積量，尤其在短時間內(nèi)，高的擴(kuò)散系數(shù)對藥物累積量影響巨大。對比3種不同的給藥方式，得出藥物累積量隨時間變化的不同規(guī)律及藥物跨角膜輸運(yùn)過程中進(jìn)入前房的藥物輸運(yùn)通量達(dá)到峰值的時間及峰值量。