趨化因子配體16在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

鄭 瑞，浦 春

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001)

進(jìn)入21世紀(jì)以來，肺癌已成為我國病死率最高的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要形式，占原發(fā)性肺癌的82%～87%，屬最常見的組織學(xué)類型[1]。大多數(shù)NSCLC患者在診斷時(shí)就已經(jīng)是晚期或伴有合并癥而不能行根治性手術(shù)。因此篩選肺癌特異性的蛋白對于肺癌患者實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療有重要意義。趨化因子配體16(C-X-C chemokine ligand 16，CXCL16)是氧化低密度脂蛋白的清道夫受體，有跨膜型和可溶解型兩種形式[2]。CXCL16對不同類型人類癌癥都有影響，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等[3-5]。激活CXCL16/CXCR6可導(dǎo)致乳腺癌和前列腺癌的進(jìn)展[6-7]。Liang等對生存曲線的分析提示，肺癌組織中CXCL16高表達(dá)，患者總體生存率降低，因此它可能是影響肺癌患者預(yù)后的消極因素[8]。本研究通過檢測人肺腺癌細(xì)胞株和NSCLC患者組織和血清中CXCL16的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討CXCL16在NSCLC中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究共使用4種人類肺腺癌細(xì)胞株(A549、 H1299、H460、H446)及人正常肺上皮細(xì)胞株(B2B)。選取 2018年9月～2019年5月在弋磯山醫(yī)院就診的NSCLC患者50例，收集患者的石蠟組織標(biāo)本和外周血血清，同時(shí)選取40例健康體檢者外周血血清。50例NSCLC患者的平均年齡為(60±8.28)歲，40例健康體檢者年齡為(58±7.50)歲。所有患者的確診均經(jīng)術(shù)后病理檢查，且術(shù)前未接受放、化療或其他治療。

1.2 試劑和原理 細(xì)胞株CXCL16的檢測使用CXCL16一抗體(abcam,ab101404)，購于美國Abcam Ltd公司，原理是蛋白質(zhì)印跡法。組織CXCL16的檢測使用兔抗人CXCL16抗體(13902-1-AP)，購自Affinity公司，原理是免疫組織化學(xué)染色。其他試劑和材料主要有二甲苯、梯度乙醇、 3% 過氧化氫、 1% 鹽酸乙醇、蘇木精等。血清CXCL16的檢測采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，試劑盒購于蘇州卡爾文生物科技有限公司。

1.3 方法及結(jié)果判斷 WB 檢測 CXCL16蛋白的表達(dá)：提取細(xì)胞株中的CXCL16蛋白，以 90V 恒壓模式進(jìn)行電泳，在350 mA、 70 min 恒流模式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)后使用Bio-Rad成像系統(tǒng)和ECL試劑盒進(jìn)行檢測，分析條帶的灰度值。組織標(biāo)本按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行制片，鏡下觀察。CXCL16陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈黃色或棕黃色顆粒。免疫組化評分依據(jù)陽性染色細(xì)胞的百分比及染色的強(qiáng)度計(jì)算，結(jié)果評判如下：<2，陰性表達(dá)(-)；≥2，陽性表達(dá)； 2～3，低表達(dá)(+)；4～7，高表達(dá)(++～+++)。所有血清標(biāo)本的采集都獲得研究對象知情同意。抽取外周靜脈血4 mL，靜置30 min離心，留取血清用于檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD 值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各血清樣本CXCL16濃度值。

2 結(jié)果

2.1 CXCL16在人肺腺癌細(xì)胞株和人正常肺上皮細(xì)胞株的表達(dá) WB檢測顯示，CXCL16在人正常肺上皮細(xì)胞B2B和肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H460、H446中均有表達(dá)，且相比于B2B細(xì)胞，4種肺癌細(xì)胞株中CXCL16的表達(dá)水平上調(diào)；與內(nèi)參蛋白β-actin相比，肺癌細(xì)胞株(A549、 H1299、H460、H446)也高于正常肺上皮細(xì)胞株(B2B)(P<0.05，見圖1、2)。

圖1 CXCL16在肺腺癌細(xì)胞株與正常肺上皮細(xì)胞株的表達(dá)

F46.218，P0.000，與B2B比較，*P<0.05，** P<0.001。

2.2 CXCL16 在NSCLC組織及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，NSCLC組織和癌旁組織細(xì)胞均可見CXCL16的陽性表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中呈棕黃色或者棕褐色(見圖3)。NSCLC組織中CXCL16表達(dá)[84.0%(42/50)]高于癌旁組織[44.0%(22/50)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.361，P=0.000)。

圖3 CXCL16在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.3 NSCLC組織中CXCL16的表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性 50例NSCLC標(biāo)本中，CXCL16均呈陽性表達(dá)，其表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、胸膜轉(zhuǎn)移及分化程度等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.4 CXCL16在NSCLC組和對照組血清中的表達(dá) NSCLC患者組血清CXCL16表達(dá)水平[(1761.28±323.58)pg/mL]高于對照組[(1035.25±201.26)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.34，P=0.000 )(見圖4)。

2.5 血清CXCL16與NSCLC組織表達(dá)的相關(guān)性 將組織中表達(dá)的免疫組化評分作為半定量值與血清中CXCL16的濃度值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，血清與組織中CXCL16表達(dá)相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs=0.032，P=0.826)。

表1 CXCL16在NSCLC組織中的表達(dá)與臨床參數(shù)資料的關(guān)系

圖4 CXCL16在NSCLC組和對照組血清中的表達(dá)

3 討論

我國肺癌的發(fā)病率和病死率非常接近，5年生存率低，NSCLC是肺癌最常見的組織學(xué)類型[1]。CXCL16 屬于趨化因子超家族成員之一，與其受體CXCR6的相互作用會(huì)促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[2]。2007年，Hojo等提出CXCL16高表達(dá)是結(jié)直腸癌的陽性預(yù)后因子[9]。Hald[10]報(bào)道發(fā)現(xiàn)CXCL16在基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)和基質(zhì)細(xì)胞與癌細(xì)胞聯(lián)合高表達(dá)是NSCLC獨(dú)立的陽性預(yù)后因素。這些提示CXCL16可能在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用，其表達(dá)情況有望為癌癥患者預(yù)測及臨床治療提供參考價(jià)值。

Hu等[11]發(fā)現(xiàn)CXCL16在人肺癌組織中高表達(dá)，也證明了CXCL16、CXCR6信號通路的激活可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。本研究通過檢測CXCL16在4種肺腺癌細(xì)胞株和人正常肺上皮細(xì)胞株的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCL16在肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于正常肺上皮細(xì)胞株，提示CXCL16/CXCR6軸在肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中可能有某些生物學(xué)意義。

Wagsater等發(fā)現(xiàn)CXCL16在多種癌癥組織中表達(dá)失調(diào)[5，12]。我們的研究顯示CXCL16在NSCLC組織中呈陽性表達(dá)，且癌組織的表達(dá)較癌旁組織上調(diào)(P<0.01)，這與Kee[5]的結(jié)論一致。但Hald等[10]在對NSCLC的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)癌組織中的CXCL16為低表達(dá)，敲除CXCL16時(shí)觀察到腫瘤增殖增加，與我們的結(jié)論不一致。CXCL16在NSCLC組織的表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)分型、TNM分期、有無淋巴結(jié)和胸膜轉(zhuǎn)移差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CXCL16的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)移組不一致?？赡芘c所選病例類型單一和樣本量少有關(guān)，同時(shí)也決定了我們接下來的研究方向：適宜的擴(kuò)大樣本規(guī)模，增加基因檢測等手段進(jìn)一步探索CXCL16的表達(dá)機(jī)制，為NSCLC的預(yù)測提供新的思路。

CXCL16可以穩(wěn)定存在于血清中，在NSCLC的血清中檢測出高水平的CXCL16尤其重要。張珺等[13]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中CXCL16高表達(dá)且與TNM分期有關(guān)，可能是預(yù)測NSCLC轉(zhuǎn)移預(yù)后的指標(biāo)。我們檢測了血清CXCL16的表達(dá)，結(jié)果提示， NSCLC組的表達(dá)比對照組上調(diào)(P<0.05)，與之前的研究一致。我們將組織與血清中CXCL16的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者無明顯相關(guān)性。這可能是由于血清中CXCL16水平主要反映可溶性的CXCL16，但可溶性CXCL16的水平可能不能代表肺中跨膜型CXCL16的水平。另外本研究的樣本量小，前期研究對象的選擇有偏移也會(huì)造成研究結(jié)果的偏差。

綜上所述，CXCL16在肺腺癌細(xì)胞系和NSCLC的組織中均高表達(dá)，同時(shí)血清中NSCLC組的表達(dá)較對照組也明顯上調(diào)，但血清CXCL16對NSCLC的臨床價(jià)值仍有待商榷，研究也有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)檢測組織中 CXCL16的mRNA水平，更深一步的論證本研究結(jié)果的可靠性， CXCL16對于NSCLC的作用機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。