惡性胸腔積液巨噬細(xì)胞CD163、ANGPTL4表達(dá)及相關(guān)性研究

秦立龍，臧蕾蕾，全 斌，牛永亮，劉 偉，潘玲玲，孫珍貴

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)是肺癌常見的并發(fā)癥，15%肺癌患者初診時(shí)合并MPE，50%患者在疾病過程中產(chǎn)生MPE[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)將MPE歸因于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胸膜或縱膈淋巴結(jié)引起胸水生成與重吸收失衡，但新的觀點(diǎn)認(rèn)為血管生成、血管通透性增強(qiáng)或炎癥反應(yīng)促進(jìn)MPE形成[2]，而宿主細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的交互作用增強(qiáng)血管生成、血管滲漏、炎癥和癌細(xì)胞侵襲。雖然宿主免疫細(xì)胞如間皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在MPE形成中的功能作用還有待確定，但巨噬細(xì)胞的重要性不斷得到重視。

巨噬細(xì)胞是胸水細(xì)胞的重要組成成分，占所有細(xì)胞一半以上。胸腔巨噬細(xì)胞衍自通過胸膜間皮襯層遷移的外周血單核細(xì)胞，MPE發(fā)生過程中巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在胸水積聚，分泌細(xì)胞因子參與炎癥和纖維化反應(yīng)。巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種表型：經(jīng)典激活型(M1)和替代活化型(M2)。M1巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎分子、觸發(fā)Th1免疫反應(yīng)，作為炎癥應(yīng)答及抗腫瘤免疫的重要細(xì)胞成分；M2主要表達(dá)抗炎分子和趨化因子，激活Th2免疫反應(yīng)；通過促進(jìn)血管生成、基質(zhì)重塑和抑制適應(yīng)性免疫促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。M1缺乏可靠的表面標(biāo)記物，M2表面受體包括血紅蛋白清道夫受體(hemoglobin scavenger receptor，CD163)、甘露糖受體CD206(mannose receptor 206)和C型凝集素受體等，其中CD163僅限于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系，為M2巨噬細(xì)胞的一個(gè)特異性標(biāo)記物[3-4]，部分研究將免疫組化鑒定的CD163+細(xì)胞作為M2巨噬細(xì)胞[5]。CD163由抗炎信號(hào)如糖皮質(zhì)激素和某些細(xì)胞因子(IL-6和IL-10)激活。研究表明，來自非惡性胸腔積液的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1表型，而MPE巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)非經(jīng)典性M2表型[6]。MPE中CD163+巨噬細(xì)胞比例及在MPE促血管生成因子生成中的重要性仍不清楚。

血管生成和血管通透性增加有助于腫瘤轉(zhuǎn)移，血管生成素樣蛋白4(angiogenin-like protein 4，ANGPTL4)是血管生成素家族成員之一，也稱為過氧化物酶體增殖活化受體PPAR γ誘導(dǎo)的血管生成素相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)血管通透性、血管生成和炎癥反應(yīng)[7]。ANGPTL4在轉(zhuǎn)移性腫瘤中高表達(dá)，表明它可能在轉(zhuǎn)移過程中起重要的作用；但研究也發(fā)現(xiàn)ANGPTL4抑制血管滲漏防止轉(zhuǎn)移，說明ANGPTL4功能可能受腫瘤微環(huán)境影響并具組織特異性。ANGPTL4也可以是癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物。

本研究通過免疫組化技術(shù)分析巨噬細(xì)胞CD163、ANGPTL4表達(dá)及胸水中ANGPTL4水平，評估CD163+巨噬細(xì)胞與ANGPTL4的相關(guān)性，探討CD163+巨噬細(xì)胞在肺癌MPE發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年1月～2015年11月在弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院確診的肺癌伴MPE患者40例，其中男15例，女性25例，平均年齡(58.08±8.04)歲；包括肺鱗癌5例，肺腺癌30例，小細(xì)胞肺癌5例。結(jié)核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion，TPE)患者20例，其中男女各10例，平均年齡(40.75±16.04)歲。所有患者均簽署知情同意書。

肺癌MPE的診斷基于胸腔積液中找到癌細(xì)胞和(或)胸膜活檢標(biāo)本病理學(xué)確診為原發(fā)性肺癌并排除任何其他轉(zhuǎn)移性癌引起的胸腔積液。TPE的診斷依據(jù)患者臨床病史、胸水腺苷脫氨酶(ADA)≥40 U/L，同時(shí)胸膜活檢標(biāo)本顯示干酪樣肉芽腫。

1.2 胸水收集和處理 留取患者入院后首次胸穿獲得的胸水約100～500 mL，3 000 r/min離心20 min，細(xì)胞沉淀制作成蠟塊，收集上清液10 mL等分儲(chǔ)存于-80℃冰箱，待檢ANGPTL4。

1.3 CD163、ANGPTL4免疫組化檢測 將新鮮胸水標(biāo)本以10%福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm組織切片。鏈霉素抗生物素-過氧化物酶連接法進(jìn)行免疫組化檢測。分別滴加鼠抗人CD163單克隆抗體(1∶150)(北京中杉金橋公司)、鼠抗人ANGPTL4多克隆抗體(1∶150)(北京博奧森公司)，PV-6000山羊抗鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金橋公司)。DAB顯色、蘇木精復(fù)染。釆用雙盲法判定免疫組化結(jié)果：先在100倍光鏡下選取4個(gè)視野較好的區(qū)域，后在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(HPF)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值，分別以CD163、ANGPTL4+巨噬細(xì)胞平均數(shù)除以巨噬細(xì)胞總數(shù)計(jì)算CD163、ANGPTL4+巨噬細(xì)胞百分比。

1.4 ELISA檢測胸水中ANGPTL4濃度 ELISA法檢測ANGPTL4濃度，操作步驟按試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)說明書進(jìn)行， ANGPTL4檢測濃度是0.39 ng/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。MPE組與TPE組CD163+細(xì)胞數(shù)、ANGPTL濃度采用中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD163在MPE、TPE巨噬細(xì)胞表達(dá)及陽性細(xì)胞百分比比較 400倍光鏡下結(jié)合CD163染色和細(xì)胞形態(tài)鑒定CD163+和CD163-巨噬細(xì)胞，CD163表達(dá)定位于胞質(zhì)或胞膜，呈黃褐色至棕黃色顆粒狀。MPE組CD163+巨噬細(xì)胞中位數(shù)97.32%(86%、126%)多于TPE組的26.41%(16.5%、33.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.276，P=0.000)。見圖1。

2.2 MPE和TPE胸水中ANGPTL4水平 ELISA檢測胸水中ANGPTL4濃度，MPE組ANGPTL4濃度中位數(shù)40.50 ng/mL(26.64 ng/mL、101.75 ng/mL)高于TPE組的27.25 ng/mL(19.51 ng/mL、50.67 ng/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.682，P=0.007)。

2.3 ANGPTL4在MPE及TPE中巨噬細(xì)胞的表達(dá) MPE多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、間皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜均表達(dá)ANPTL4，呈黃褐色至棕黃色顆粒狀，所有巨噬細(xì)胞均呈陽性；TPE部分巨噬細(xì)胞表達(dá)ANGPTL4(圖2)，陽性細(xì)胞占(76.50±14.37)%。

A.MPE；b.TPE。

A.MPE；b.TPE。

2.4 MPE中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量與胸水上清液中ANGPTL4濃度相關(guān)性 對MPE中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)與ANGPTL4濃度的關(guān)系進(jìn)行秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示， CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)與ANGPTL4濃度存在相關(guān)關(guān)系(rs=0.912，P=0.000)。

3 討論

胸腔積液巨噬細(xì)胞是研究免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用的一種重要成分，已證明來自惡性胸腔積液的巨噬細(xì)胞自然殺傷活性和殺死腫瘤細(xì)胞能力削弱。M2巨噬細(xì)胞在癌癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CD163為M2c巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[3]。既往采用流式細(xì)胞儀研究MPE中巨噬細(xì)胞分類，發(fā)現(xiàn)惡性胸水中巨噬細(xì)胞以非經(jīng)典性M2型為主[6]。本研究著重于觀察胸腔積液微環(huán)境中CD163+巨噬細(xì)胞比例及ANGPTL4的表達(dá)，將胸腔積液離心沉淀制成蠟塊，采用免疫組化技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞CD163的表達(dá)，觀察到相對于TPE，肺癌MPE中巨噬細(xì)胞數(shù)量和胞膜及胞質(zhì)CD163染色強(qiáng)陽性的巨噬細(xì)胞百分比更高，此與以往研究結(jié)果基本一致，提示CD163+巨噬細(xì)胞在MPE發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用，更多的CD163+巨噬細(xì)胞有利于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，新生血管形成，而MPE微環(huán)境多種介質(zhì)有利于巨噬細(xì)胞表型分化，促進(jìn)MPE發(fā)展。我們認(rèn)為巨噬細(xì)胞數(shù)量和百分比提供不同的信息和含義：MPE較TPE巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量增多，這可能源于循環(huán)單核細(xì)胞更多的募集和分化；而百分比更好地反映分化過程中的環(huán)境，CD163+巨噬細(xì)胞也可能成為鑒別良惡性胸腔積液的指標(biāo)之一。此外，本研究中我們對CD163+巨噬細(xì)胞的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)多種CD163表達(dá)強(qiáng)陽性的細(xì)胞融合，提示MPE中巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生異型細(xì)胞融合。

腫瘤微環(huán)境豐富的IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1等有利于M2型巨噬細(xì)胞極化，M2(M2c)巨噬細(xì)胞也分泌抗炎介質(zhì)如IL-10[5]。從另一方面證明CD163+巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞，增多的IL-10促進(jìn)血管生成和抗細(xì)胞凋亡從而增加肺腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能。

血管生成是實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移獲取養(yǎng)分的重要條件，ANGPTL4是一種新型分泌糖蛋白，可以促進(jìn)血管生成、腫瘤發(fā)生、腫瘤侵襲、抗失巢凋亡[8]，其功能作用取決于組織環(huán)境和轉(zhuǎn)錄后修飾狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)MPE中多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、癌細(xì)胞、間皮細(xì)胞表達(dá)ANGPTL4，所有的巨噬細(xì)胞均為ANGPTL4陽性，同時(shí)上清液中ANGPTL4蛋白表達(dá)量也明顯高于TPE；相關(guān)分析示MPE中ANGPTL4表達(dá)水平與CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)，提示MPE中ANGPTL4部分可能分泌自CD163+巨噬細(xì)胞，對MPE形成產(chǎn)生重要影響，巨噬細(xì)胞分泌ANGPTL4并釋放到MPE中，增加胸膜毛細(xì)血管通透性并便于癌細(xì)胞播散；惡性胸腔積液微環(huán)境中ANGPTL4表達(dá)增加也可能參與巨噬細(xì)胞極化類型的調(diào)節(jié)。MPE中ANGPTL4的上調(diào)與MPE缺氧微環(huán)境缺氧誘導(dǎo)因子1α有密切關(guān)系[8]。

本研究局限性在于僅觀察了CD163，而對M2巨噬細(xì)胞其他標(biāo)志物及M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物均未檢測，因此可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)論過于簡單化；使用免疫細(xì)胞化學(xué)法分析屬半定量測量，也可能導(dǎo)致不正確的解釋。此外，本研究收集的樣本例數(shù)偏小，可能引起結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差?？傊珻D163+巨噬細(xì)胞在肺癌MPE發(fā)生中的作用、是否與預(yù)后相關(guān)，有待進(jìn)一步觀察研究。