葛根素聯(lián)用沙格列汀在高糖環(huán)境下對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響

張一順，李 曙，金 鑫

(1.馬鞍山市人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 馬鞍山 243000；2.皖南醫(yī)學院 a.臨床醫(yī)學院；b.藥學院，安徽 蕪湖 241002)

隨著社會環(huán)境和人們飲食習慣的逐漸改變，心血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生率也越來越高。截至2018年，全國心血管疾病的患病率已達20.8%，在居民疾病死亡構(gòu)成中占比達到40%以上，居于首位[1]。相關(guān)研究表明，血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能異常是導致高血壓、血栓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的病理基礎[2-3]。在糖尿病心血管疾病發(fā)病中，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷是重要基礎[4]。從葛根中提取的活性成分葛根素，屬于異黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎等作用，在心血管系統(tǒng)疾病中具有重要作用[5]。沙格列汀是一種高效的二肽基肽酶-4(dipeptidyl pepti-dase 4，DPP-4)抑制劑，可通過選擇性抑制DPP-4調(diào)節(jié)機體血糖的變化[6]，且對腎臟也具有保護作用。本研究探討葛根素聯(lián)合沙格列汀對高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的損傷的影響，為臨床上糖尿病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 葛根素(方明藥業(yè))；沙格列汀(中美上海施貴寶)；DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone公司)；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博)；β-actin 上游引物序列為5′-CAGAGCAAGAGAGGCATC-3′，下游引物序列為5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCT-3′(216 bp)，P-選擇素上游引物：5′-CCAGACAATGGACGGCAGCAG-3′，下游引物：5′-AGGGCITGGGTCAAACGCAGCA-3′(424bp)，NF-κB p65上游 5′-ATGTGCATCGGCAAGTGG-3′，下游 5′-CAGAAGTTGAGTTTCGGG TAG-3′(294 bp)(美國Santa Cruz)。

1.2 主要儀器 Beckman Coulter FC500 MCL流式細胞儀、離心機(安科)、水套式CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、高速冷凍離心機(Thermo)、BIO-RAD梯度PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs的分離和培養(yǎng) 無菌環(huán)境下，取新生兒臍帶組織，將臍靜脈采用0.1%膠原酶消化、分離，細胞接種濃度為1×106，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.125%胰酶-0.02%EDTA 溶液消化傳代。3～6代的細胞用于實驗。

1.3.2 實驗設計與分組 將葛根素溶于0.02%二甲亞砜中配置成葛根素的藥物母液，將沙格列汀溶于0.02%二甲亞砜中配置成沙格列汀的藥物母液。使用高糖培養(yǎng)基(30 mmol/L)刺激HUVECs細胞24 h，不同梯度濃度葛根素(5、10、20、40、80 μmol/L)和沙格列汀(2.5、5、10、20、40 μmol/L)觀察藥物效應，MTT法檢測，實驗重復3次，選擇用藥濃度后隨機分為5組：空白對照組、高糖組、高糖組+沙格列汀組、高糖組+葛根素組、高糖組+沙格列汀+葛根素組(聯(lián)合用藥組)，給藥。處理時間為24 h。

1.3.3 觀察指標

1.3.3.1 顯微鏡下觀察各組細胞狀態(tài)并拍照。

1.3.3.2 AnnexinⅤ-FITC/PI檢測細胞凋亡 待細胞生長至對數(shù)期，消化離心，種于6孔板，藥物處理后，將細胞用胰酶(0.25%不含EDTA)消化，收集懸浮細胞于10 mL離心管中，離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌重懸1次，離心5 min，孵育緩沖液重懸，置于流式管中，加入FITC 5 μL避光孵育15 min，再加入PI避光孵育5 min，于1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。流式分析計算出不同分組凋亡細胞以及存活細胞百分比。

1.3.3.3 Q-PCR檢測P-選擇素和NF-κB p65 mRNA表達水平 提取HUVECs細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進行RT反應。所得cDNA在實時熒光定量PCR儀(7300 Real Time PCR System，Applied Biosystem)上進行反應。用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計△△Ct值，計算RQ值以比較各組mRNA的表達。

2 結(jié)果

2.1 正常 HUVECs的培養(yǎng) 顯微鏡下可見正常 HUVECs單層貼壁生長，細胞呈短梭形或多角形，呈“鋪路石”樣(圖1A)，與空白對照組相比，高糖組內(nèi)皮細胞形態(tài)皺縮，細胞數(shù)目減少，細胞間縫隙變大，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞活力明顯降低(圖1B)，與高糖組相比，各給藥組細胞形態(tài)改善，細胞數(shù)量增加，其中聯(lián)合用藥組最為明顯(圖1C、D、E)。

A.空白對照組;B.高糖組;C.沙格列汀用藥組;D.葛根素用藥組;E.聯(lián)合用藥組。

2.2 MTT檢測 ①葛根素不同濃度組細胞增殖差異均有統(tǒng)計學意義；②其他各濃度組間細胞增殖差異均有統(tǒng)計學意義。根據(jù)濃度作用效果，結(jié)合相應參考文獻[7-9]，本研究選用葛根素20 μmol/L與沙格列汀10 μmol/L分別作為單用藥實驗濃度，葛根素10 μmol/L+沙格列汀5 μmol/L作為聯(lián)用藥實驗濃度。見表1。

2.3 流式細胞儀分析結(jié)果 與空白對照組(9.37±0.91)%比較，高糖可誘導內(nèi)皮細胞明顯凋亡，其凋亡率為(71.43±9.30)%，與高糖組比較，聯(lián)合用藥組可阻止高糖誘導內(nèi)皮細胞凋亡，分別降至(52.17±9.31)%、(39.13±5.17)%。見圖2、表2。

2.4 Real-time PCR檢測結(jié)果 與空白對照組相比，高糖組內(nèi)皮細胞P-選擇素和NF-κB p65 mRNA表達升高(P<0.05)。與高糖組比較，聯(lián)合用藥組內(nèi)皮細胞P-選擇素和NF-κB p65mRNA表達水平降低(P<0.05)。見表3。

表1 不同藥物濃度組MTT值的比較

A.空白對照組;B.高糖組;C.沙格列汀用藥組;D.葛根素用藥組;E.聯(lián)合用藥組。

表2 各組細胞凋亡率比較

表3 各組P-選擇素和NF-κB mRNA的相對表達量

3 討論

血管內(nèi)皮細胞功能障礙、結(jié)構(gòu)受損是多種心腦血管疾病重要始動環(huán)節(jié)之一。血管內(nèi)皮是血管內(nèi)膜的一道重要屏障，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)患者內(nèi)皮細胞損傷發(fā)生心血管疾病的概率明顯高于無內(nèi)皮功能受損患者。高血糖是導致血管內(nèi)皮功能損傷的主要因素之一，隨著機體血糖濃度的升高，血管舒張功能下降[11]，且血管內(nèi)皮細胞受高糖誘導發(fā)生損傷時，也會引起內(nèi)皮細胞的功能紊亂，這也是誘發(fā)糖尿病患者出現(xiàn)心腦血管并發(fā)癥的重要因素，然而糖尿病中血管并發(fā)癥又是主要致死致殘原因[12]。因此研究具有重要意義，本實驗以高糖環(huán)境下培養(yǎng)HUVECs建立細胞損傷模型，探討葛根素聯(lián)用沙格列汀對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用及可能機制。

P-選擇素在多種疾病(血栓形成、炎癥反應等)的發(fā)生過程中都起到重要作用，其主要通過介導細胞與細胞或細胞與細胞基質(zhì)間的黏附[13]，同時P-選擇素在介導白細胞黏附以及血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及細胞外信號傳導等過程中均發(fā)揮重要作用[14]。當高糖活化細胞后，P-選擇素迅速與胞膜融合，在細胞膜上進行表達。該實驗中，高糖組P-選擇素 mRNA表達上調(diào)，使用藥物處理后，P-選擇素 mRNA表達被逆轉(zhuǎn)，表明葛根素與沙格列汀的聯(lián)合使用可有效抑制白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，進而抑制血小板的激活。因此，上述兩種藥物的聯(lián)合使用可以抑制糖尿病心腦血管并發(fā)癥的形成。

2004年Chandrasekar等[15]的研究闡述了細胞炎性反應的過程涉及了NF-κB信號通路的激活，并且影響了炎性以及代謝性疾病的發(fā)生。2011年Oeckinghaus等[16]研究證明NF-κB信號通路的激活可提高體內(nèi)細胞因子的分泌進而誘發(fā)慢性炎癥的過程，最終損傷細胞導致相應疾病。該研究中，高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷，P-選擇素和NF-κB mRNA的表達明顯升高，而在聯(lián)合用藥處理后，P-選擇素和NF-κB mRNA的表達水平也明顯下調(diào)。提示高糖致血管內(nèi)皮細胞損傷提高P-選擇素的表達可能涉及NF-κB信號通路的參與，進而影響糖尿病心腦血管并發(fā)癥形成。

綜上所述，葛根素與沙格列汀的聯(lián)合使用可有效抑制高糖條件下人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡，其機制可能是通過阻斷NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導，降低P-選擇素水平實現(xiàn)對VEC保護的生物學效應，這為進一步研究葛根素聯(lián)合沙格列汀用于預防糖尿病心腦血管并發(fā)癥展現(xiàn)出樂觀的前景。