梯度洗脫波長切換HPLC同時測定茵梔解毒顆粒中3個成分的含量

鄭舉 劉紅云 陳靜

摘要 [目的]建立同時測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、黃芩苷、梔子苷3個成分含量的方法。[方法]采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）～0.2% 磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長327 nm（0～9.5 min，測定綠原酸）、238 nm（9.5～14.0 min，測定梔子苷）、278 nm（14～30 min，測定黃芩苷）。[結(jié)果]各待測組分分離度良好;綠原酸、黃芩苷、梔子苷3個成分的進樣量分別在5.01～100.00 μg/mL（r=0.999 7）、6.25～100.00 μg/mL（r=0.999 5）、10.86～400.00 μg/mL （r=0.999 3）與峰面積呈良好的線性關系;加樣回收率分別為98.5%、100.0%、99.0%（n=6），RSD分別為0.2%、0.7%、0.4%。[結(jié)論]該試驗建立的含量測定方法符合方法學驗證要求，可用于茵梔解毒顆粒的3個指標性成分的同時測定。該方法簡便、準確度高、重復性好，為進一步控制茵梔解毒顆粒的質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

關鍵詞 茵梔解毒顆粒;綠原酸;黃芩苷;梔子苷;含量測定;高效液相色譜;梯度洗脫;波長切換

中圖分類號 R284.1 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）21-0198-04

Abstract [Objective]To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid， baicalin and geniposide in Yinzhi Jiedu granules.[Method]The chromatographic separation was carried out on a Agilent Eclipse XDBC18 column（ 4.6 mm × 250 mm，5 μm） with a mobile phase consisting of acetonitrile （A）-0.2% phosphoric acid solution（ B） in a gradient mode at a flow rate of 1 mL/min.Column temperature was 30 ℃，the UV detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid in the first 9.5 min，238 nm for geniposide during 9.5-14.0 min，278 nm for baicalin during 14-30 min.[Result]Excellent chromatographic separation was achieved and the ranges for linear correlation of chlorogenic acid，baicalin and geniposide were 5.01-100.00 μg/mL （r=0.999 7），6.25-100.00 μg/mL （r=0.999 5），10.86-400.00 μg/mL （r=0.999 3），respectively.The sample recovery rates were 98.5%， 100.0%， and 99.0% （n = 6）， and the RSD were 0.2%， 0.7%， and 0.4%， respectively.[Conclusion]This method is consistent with the method validation requirements，and can simultaneously determine the above 3 index components of Yinzhi Jiedu granules.The method is simple， accurate and repeatable， and provides a basis for further control of the quality standard of Yinzhi Jiedu granules.

Key words Yinzhi Jiedu granules;Chlorogenic acid;Baicalin;Geniposide;Content determination;HPLC;Gradient elution;Wavelength shift

作者簡介 鄭舉（1973—），男，安徽蕭縣人，高級獸醫(yī)師，從事畜禽產(chǎn)品安全、動物防疫工作。*通信作者，高級獸醫(yī)師，碩士，從事中獸藥檢測技術(shù)研究。

收稿日期 2020-03-13;修回日期 2020-04-15

茵梔解毒顆粒由茵陳、梔子、虎杖、黃芩、鉤藤5味中藥組成，該藥物具有清熱解毒、疏肝解痙之功效，獸醫(yī)臨床用于雛鴨病毒性肝炎[1-5]。茵梔解毒顆粒為《獸藥質(zhì)量標準》2017年版（中藥卷）收錄的中藥制劑，但只測定其中綠原酸的含量，對其他成分未有規(guī)定，不利于整體控制藥品的質(zhì)量。該試驗在相關文獻的基礎上[6-16]，以其中3種藥材的代表性成分為檢測指標，建立了同一流動相條件下同時測定茵梔解毒顆粒中茵陳、梔子、黃芩的3個特征性成分綠原酸、梔子苷、黃芩苷成分含量的HPLC法，既提高了制劑的質(zhì)量控制，又簡化了日常操作，為完善其質(zhì)量標準提供了參考依據(jù)，對于該藥標準的修訂具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（四元梯度泵/G1311A，自動進樣器/G1379A，真空在線脫氣機，G1315DAD檢測器），美國Agilent公司;EX125DZH十萬分之一分析天平（奧豪斯儀器有限公司）;Sartorius BP211D萬分之一分析天平（德國賽多利斯）;水由實驗室MILLI-Q超純水自制; SK7200HP型超聲波清洗器（上?？茖В?手動移液器（Eppendorf，德國）;0.45 μm混合濾膜（美國Waters公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（Thermo Fisher Scientific公司）為色譜純，其余試劑為分析純，超純水、蒸餾水為自制。茵梔解毒顆粒由安徽省某獸藥有限公司提供（批號 20190811、20190712、20190919、20191010、20191101）。對照品綠原酸（批號 Z0261702，規(guī)格 98.3%）購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，梔子苷（批號110749-201617，規(guī)格98.4%）、黃芩苷（批號110715-201720，規(guī)格 93.52%）購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。

采用 Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）～ 0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，13%A;5～10 min，13%A～30%A;10～15 min，30%A～85%A;15～25 min，85%A;25～26 min，85%A～13%A;26～30 min，13%A），流 速1 mL/min，檢測波長327 nm（0～9.5 min，測定綠原酸）、238 nm（9.5～14.0 min，測定梔子苷）、278 nm（14～30 min，測定黃芩苷），柱溫 30 ℃，進樣量 10 μL。在上述色譜條件下，各待測組分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于6 000。在此條件下，色譜圖及光譜圖如圖1～4所示。

1.3.2 對照品儲備液的制備。

精密稱取綠原酸、梔子苷、黃芩苷的對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為綠原酸 1.0 mg/mL、梔子苷1.0 mg/mL、黃芩苷0.1 mg/mL的溶液。作為對照品儲備液。

1.3.3 混合對照品溶液的制備。

精密吸取綠原酸對照品儲備液250 μL、梔子苷對照品儲備液 500 μL、黃芩苷對照品儲備液 2 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為綠原酸 25.86 μg/mL、梔子苷50.15 μg/mL、黃芩苷 200.18 μg/mL 的混合對照品溶液，冷藏，備用。

1.3.4 供試品溶液的制備。

將茵梔解毒顆粒研細，過40目篩，精密稱取3.0 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)為50%甲醇50 mL，稱量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz），提取10 min，放冷再稱量，加體積分數(shù)為50%甲醇水溶液補足減失的量，加500 μL冰醋酸，取適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液上機分析。

1.3.5 陰性樣品溶液的制備。按處方分別制備缺少茵陳、梔子和黃芩的陰性對照溶液。按“1.3.4”供試品溶液的制備方法進行制備，即得3種陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗

混合對照品溶液、供試品溶液及缺茵陳、缺梔子、缺黃芩的3種陰性對照溶液各10 μL，在“1.3.1”色譜條件下分別注入色譜儀，進行分析，根據(jù)色譜圖的出峰時間，得出茵梔解毒顆粒在與綠原酸、梔子苷、黃芩苷對照品相應的位置上，均有相同保留時間的色譜峰，而缺茵陳的陰性對照溶液無綠原酸色譜峰，缺梔子的陰性對照溶液中無梔子苷色譜峰，缺黃芩的陰性對照溶液無黃芩苷色譜峰，說明茵梔解毒顆粒中其他成分對這3個成分的檢測不產(chǎn)生干擾，方法的專屬性好。同時依據(jù)DAD檢測器的峰純度檢測功能，得出3種成分的純度角度小于純度閾值，說明樣品的成分得到良好的分離。

2.2 線性關系考察

分別精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置5 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照“1.3.1”色譜條件進行測定。以峰面積（Y）為縱坐標、對照品溶液的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸分析計算，結(jié)果見表 1。 從表1可以看出，綠原酸、梔子苷、黃芩苷在定量測定范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 精密度試驗

取同一混合對照品溶液，按“1.3.1”色譜條件連續(xù)進樣6次測定，記錄峰面積。計算得出綠原酸、梔子苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為 0.8%、1.1%、0.6%，均符合要求，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液10 μL，室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“1.3.1”色譜條件下進樣分析，記錄峰面積。計算得出綠原酸、梔子苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.5%、0.3%、0.4%，表明供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗

精密稱取茵梔解毒顆粒（批號20190811）的樣品6份，每份3.0 g，按“1.3.4”方法制得供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣分析，按外標法計算各組分含量及其RSD。測得綠原酸、梔子苷、黃芩苷的含量平均值分別為0.358、0.701、3.156 mg/g，RSD分別為 0.8%、0.6%、0.7%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗

取已知含量的茵梔解毒顆粒（批號20190811）粉末6份，每份約2.0 g，精密稱定，精密加入已知濃度的綠原酸、梔子苷、黃芩苷對照品的混合溶液2 mL，按“1.3.4”方法制成供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，綠原酸、梔子苷、黃芩苷的平均加樣回收率及RSD均符合要求。

2.7 含量測定

精密稱取茵梔解毒顆粒5份，按“1.3.4”方法制成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣分析，外標法進行含量測定。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

利用單因素考察法，對提取方法、提取溶劑、提取時間3個因素進行了考察。在提取溶劑濃度的選擇上，比較了濃度25%、50%、75%、100%的甲醇對各組分的提取效果，試驗結(jié)果顯示，50%甲醇提取茵梔解毒顆粒中的3種成分含量最高。在提取方法上分別選擇超聲、回流2種提取方法，結(jié)果顯示超聲提取效率最高，且簡便快捷。與此同時在超聲提取時間上分別比較了5、10、15、20、30 min對茵梔解毒顆粒的提取效果，試驗結(jié)果顯示，樣品在超聲 10 min 提取效率達到最高。最終選擇的提取方法是用50%甲醇超聲提取10 min。

3.2 檢測波長的選擇

同一物質(zhì)在不同檢測波長下具有不同的響應值。在該試驗中利用DAD（光電二極管陣列檢測器）對這3種化合物進行190～400 nm掃描，根據(jù)綠原酸、梔子苷、黃芩苷的特征光譜圖，確定這3種物質(zhì)的最大吸收波長，同時結(jié)合流動相的梯度洗脫的特性，可以將復雜基質(zhì)的成分進行分離，最終確定為 0～9.5 min 時327 nm測定綠原酸，9.5～14.0 min 時238 nm測定梔子苷，14～30 min 時 278 nm測定黃芩苷。

3.3 流動相的選擇

該試驗考察了多種流動相體系，首先以甲醇-水（13∶87）、甲醇-磷酸-水（30∶0.1∶70）作為流動相，進行等度、梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸和梔子苷的分離效果不太好，又考察了乙腈-磷酸-水、等度和梯度，發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫時3種化合物得到的色譜峰符合分離要求，最后篩選出乙腈和磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫。經(jīng)試驗驗證，該流動相體系基線平穩(wěn)、無拖尾現(xiàn)象，3種成分色譜峰分離度達到要求，符合系統(tǒng)適用性的要求。故以此為該檢測方法的流動性。

3.4 耐用性考察

根據(jù)“1.3.1”色譜條件，分別考察了4款不同品牌的色譜柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Thermo HyPurity C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），設定了3個柱溫（25、35、40 ℃）、3個流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），結(jié)果表明上述條件下各組分的分離度和理論塔板數(shù)均能達到要求，證明該方法耐用性較好。

4 小結(jié)

該試驗建立了HPLC-DAD波長切換法同時測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的方法，保證各成分在最大吸收波長處檢測，且僅使用1個色譜條件即可實現(xiàn)多個指標成分的質(zhì)量分析。方法學驗證結(jié)果符合《中國獸藥典》2015年版中質(zhì)量分析方法驗證指導原則的要求。該方法的供試品溶液制備簡便快捷，所建立的梯度洗脫方法分離度好，測定結(jié)果準確、重復性好、實用性強，有利于茵梔解毒顆粒整體質(zhì)量的控制。

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