志賀菌ipaH基因PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

文英 何永彩

摘要 為了掌握青海省4種食源性動物體內(nèi)志賀菌的分布情況，針對志賀菌屬侵襲性質(zhì)?？乖璈基因（invasive plasmid，ipaH）設(shè)計1對特異性引物，建立志賀菌的PCR檢測方法，優(yōu)化反應(yīng)體系，檢測該方法的敏感性和特異性，并將該方法應(yīng)用于臨床樣本檢測。結(jié)果表明，建立的PCR方法能特異性擴增志賀菌ipaH基因，而沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌等均未擴增出條帶;最低檢測限值為1.8 pg/μL。在臨床樣本檢測中，100株疑似菌株的陽性率為62.00%，其中牦牛源75.00%（3/4），雞源35.29%（12/34），羊源44.44%（8/18），豬源88.64%（39/44）;新鮮雞糞和羊糞的陽性率分別為91.67%（11/12）和90.91%（10/11）。這說明試驗所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特異性，可應(yīng)用于志賀菌的實驗室診斷;4種動物體內(nèi)均不同程度帶菌，在臨床診斷和治療時不可忽視該菌的致病作用。

關(guān)鍵詞 志賀菌;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）;ipaH基因

中圖分類號 R378.2 ?文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0103-04

Abstract In order to grasp the distribution of 4 kinds of foodborne Shigella sp.in animals in Qinghai Province，a pair of specific primers were designed according to Shigella invasive plasmid antigen H gene（invasive plasmid，ipaH） to establish PCR detection ?method for Shigella sp..The reaction system was optimized，and the sensitivity and specificity of the method were detected.And this method was applied to detect the clinical samples.The results showed that the PCR method established by the experiment could specifically amplify the ipaH gene of Shigella sp.，but Salmonella sp.，Escherichia coli，Staphylococcus sp.，Bacillus subtilis，Proteus vulgaris，etc.did not amplify the specific band.The minimum detection limit was 1.8 pg/μL.Among the detected clinical samples，the positive rate of 100 suspected strains was 62.00%.And the positive rate of yakborne，chickenborne，sheepborne，pigborne Shigella sp.were 75.00%（3/4）， ?35.29%（12/34）， 44.44%（8/18） and 88.64%（39/44） respectively.The positive rates of fresh chicken manure and sheep manure were 91.67%（11/12） and 90.91%（10/11），respectively.The results showed that PCR method established by the experiment had good sensitivity and specificity，and the method could be applied in the laboratory diagnosis of Shigella sp..The four kinds of animals carried pathogen in different degrees，so the pathogenic role of Shigella sp.could not be ignored in clinical diagnosis and treatment.

Key words Shigella sp.;Polymerase chain reaction（PCR）;ipaH gene

基金項目 青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項目（NMSY-2017-03）。

作者簡介 文英（1974—），女，青海西寧人，副教授，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期 2020-03-12

志賀菌為革蘭陰性兼性厭氧菌，在自然界中分布廣泛，是一類具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的腸道致病菌。志賀菌屬（Shigella）是從多個獨立的大腸桿菌（Escherichia coli）起源并經(jīng)過趨同進化而形成的，可分為4 個種群[1]。國內(nèi)外大量研究表明，志賀菌不僅感染人類，而且也會感染多種動物，包括雞、牛、豬、兔、犬、狐貍和猴等多種動物，以腹瀉和腸道病變?yōu)橹饕Y狀，尤其是幼齡動物的發(fā)病率和死亡率均很高。該病不僅嚴(yán)重危害了動物健康，而且給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-9]。

為摸清青海省4種食源性動物體內(nèi)志賀菌的分布情況，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫己發(fā)表的志賀菌屬侵襲性質(zhì)粒抗原H（invasive plasmid，ipaH）編碼基因序列，設(shè)計1對特異性引物，建立PCR檢測方法，并對不同動物源樣本進行志賀菌的PCR檢測，以期豐富青海地區(qū)志賀菌流行病學(xué)資料，也可為相關(guān)疾病的防治提供一定的理論依據(jù)。

不高，原因與糞便中其他菌群占優(yōu)勢，而目的菌群處于劣勢，在菌株分離純化的過程中沒有被分離出來;志賀菌不同種間及同種不同菌株間生化特性有差異，常規(guī)分離鑒定易造成丟菌[15]，

且樣品長時間凍存也會導(dǎo)致分離率的下降有關(guān)，因此該試驗避開了常規(guī)分離鑒定的不足，僅收集在SS培養(yǎng)基上符合志賀菌菌落形態(tài)的菌株，直接用PCR方法進行檢測，一定程度上提高了檢出率，省時省力，并可為后續(xù)的分離鑒定工作帶來方便。楊小蓉等[16]報道，當(dāng)人糞便樣本中人工接種菌量在104 CFU/mL以上時，不需要增菌，可直接從糞便樣本中檢出志賀菌。該試驗采集動物新鮮糞便后直接提取DNA進行了PCR檢測，結(jié)果陽性檢出率（雞源90.91%、羊源91.67%）很高，說明建立的PCR方法在動物臨床樣本中志賀菌的快速檢測方面具有一定的應(yīng)用前景，可為預(yù)防和控制由志賀菌感染疾病的流行提供技術(shù)手段。

檢測結(jié)果也顯示，在4種食品動物體內(nèi)均不同程度攜帶志賀菌，雖然大多數(shù)動物臨床上并沒有腹瀉癥狀，但還可檢測出志賀菌，提示在不同種動物腹瀉病和非腹瀉病的臨床診斷和治療時不可忽視該菌的致病作用。鑒于志賀菌對公共健康的嚴(yán)重威脅，加強食源性動物健康帶菌的監(jiān)測及規(guī)范屠宰加工、運輸、儲存等環(huán)節(jié)的操作也十分重要。

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