基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究蟲草素抗癌的分子機(jī)制

武亭宇，鄭 雅，王博龍

宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院(江西 宜春 336000)

據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)2018年的報(bào)告，我國(guó)每年新增癌癥患者309萬(wàn)，癌癥死亡人數(shù)196萬(wàn)，分別占全球新增癌癥病例和死亡人數(shù)的22%和27%[1]。自2003年以來(lái)，中國(guó)抗癌藥品市場(chǎng)規(guī)模同比整體上均保持了兩位數(shù)的增長(zhǎng)，總額從2003年的121億一路攀升到2015年的近1 000億[2]。雖然臨床上使用的抗癌藥物種類繁多，但大多數(shù)藥物價(jià)格高昂，有嚴(yán)重的毒副作用。因此，尋找療效確切、作用機(jī)制清楚、毒副作用小的抗癌藥物是醫(yī)藥工作者奮斗的目標(biāo)之一。

蟲草素(Cordycepin)也稱3’-脫氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，是從蛹蟲草發(fā)酵液中提取的一種含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿。研究發(fā)現(xiàn)[3]蟲草素具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。其抗癌作用尤為顯著，對(duì)人的白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、鼻咽癌KB細(xì)胞、Lewis肺癌、宮頸癌HeLa細(xì)胞等多種癌細(xì)胞均能產(chǎn)生明顯的抑制作用[4-5]，但具體作用機(jī)制卻不甚清楚。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘蟲草素的抗癌靶點(diǎn)，進(jìn)行靶點(diǎn)的蛋白互作分析、基因本體(GO)功能分析，以及京都靶點(diǎn)與靶點(diǎn)組百科全書(KEGG)通路分析，并對(duì)主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以期全面闡明蟲草素的抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件①活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)：BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、CTD(http://ctdbase.org/)；②疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)：GeneCards(https://www.genecards.org/)、Open Targets Platform(https://www.targetvalidation.org)；③蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)：STRING(https://string-db.org/)；④生信在線分析平臺(tái)：OmicShare(http://omicshare.com/)、R軟件(version 3.6.1)；⑤網(wǎng)絡(luò)分析及作圖軟件Cytoscape 3.7.2、Venny 2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)；⑥化合物及蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件：ChemicalBook(https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)、ChemBio3D、PDB(http://www.rcsb.org/)；⑦分子對(duì)接相關(guān)軟件：分子三維結(jié)構(gòu)處理軟件PyMOL、AutoDuck Vina[5]及AutoDuck Tools。

1.2蟲草素靶點(diǎn)集合篩選在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“CHONG CAO SU”，設(shè)置靶點(diǎn)分閾值為20，P≤0.05，搜索獲取蟲草素靶點(diǎn)。在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中，關(guān)鍵詞設(shè)置為“Chemicals”，輸入“Cordycepin”，搜索蟲草素靶點(diǎn)。將以上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)合并去重得到蟲草素靶點(diǎn)。

1.3癌癥靶點(diǎn)篩選及蟲草素抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分別在GeneCards、OpenTargets Platform數(shù)據(jù)庫(kù)輸入關(guān)鍵詞“cancer”，檢索癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，將以上數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的癌癥靶點(diǎn)按照相關(guān)度打分，從高到低依次選分?jǐn)?shù)前2 000個(gè)靶點(diǎn)。再將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的癌癥靶點(diǎn)與蟲草素靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0軟件，取三者交集作為蟲草素抗癌靶點(diǎn)，將蟲草素及其抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建蟲草素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4蟲草素抗癌靶點(diǎn)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.3中所獲得的蟲草素抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白PPI，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence=0.4”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。將 PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用“Network Analysis”功能計(jì)算各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)、介數(shù)(Betweenness)及最短路徑(Closeness)等拓?fù)鋮?shù)，節(jié)點(diǎn)的Degree、Betweenness、Closeness數(shù)值越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置就越重要[6]。選取Degree、Betweenness、Closeness同時(shí)在平均值之上的靶點(diǎn)作為蟲草素抗癌的主要靶點(diǎn)。

1.5蟲草素抗癌靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析將蟲草素抗癌靶點(diǎn)的名稱在ensembl網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/biomart/martview)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的靶點(diǎn)ID后，運(yùn)用OmicShare云平臺(tái)進(jìn)行動(dòng)態(tài)GO富集分析。運(yùn)用R軟件，將蟲草素抗癌靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Gene Symbol后，采用R軟件“clusterProfiler”插件進(jìn)行蟲草素抗癌靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析。

1.6蟲草素與癌癥主要靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證在ChemicalBook數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蟲草素的2D結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入ChemBio3D后，以mol2的格式保存其3D結(jié)構(gòu)。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索蟲草素抗癌的靶點(diǎn)蛋白晶體復(fù)合物，借助PyMOL軟件去除蛋白中的水分子、磷酸根及多余的非活性配體，分離靶蛋白與原配體。將分離后的靶蛋白導(dǎo)入AutoDuck Tools軟件進(jìn)行加氫、加電荷等操作。再將靶蛋白、蟲草素、原配體統(tǒng)一在AutoDuck Tools中轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。以原配體所在位點(diǎn)為活性口袋進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)比分析原配體及蟲草素與靶蛋白的親和力。

2 結(jié)果

2.1蟲草素抗癌靶點(diǎn)及其網(wǎng)絡(luò)將BATMAN-TCM、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的靶點(diǎn)合并去重，得到蟲草素靶點(diǎn)107個(gè)。將蟲草素靶點(diǎn)與GeneCards、OpenTargets Platform的癌癥靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0軟件，去重得到31個(gè)蟲草素抗癌靶點(diǎn)(圖1)。將蟲草素及31個(gè)抗癌靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，得到蟲草素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

圖1 蟲草素-抗癌靶點(diǎn)韋恩圖

菱形表示蟲草素，圓形表示抗癌靶點(diǎn)圖2 蟲草素-抗癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2抗癌靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示，每個(gè)參與互作的靶點(diǎn)用一個(gè)圓形表示，圓形面積越大表示其Degree越大，圓形的邊框越粗表示其Betweenness越大。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有31個(gè)節(jié)點(diǎn)，154條相互作用連線，平均Degree為9.94，平均Betweenness為3.26×10-2，平均Closeness為5.45×10-2，Degree、Betweenness、Closeness同時(shí)在平均值之上的靶點(diǎn)有6個(gè)(表1)，說明它們處于PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置，可能是蟲草素發(fā)揮抗癌作用的主要靶點(diǎn)。分析6個(gè)主要靶點(diǎn)，可分為調(diào)控細(xì)胞凋亡的TP53、CASP3、BCL2L1、XIAP，調(diào)控細(xì)胞增殖的AKT1，調(diào)控細(xì)胞周期的CDKN1A。

表1 主要靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

圖3 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3抗癌靶點(diǎn)的GO功能及富集分析運(yùn)用OmicShare云平臺(tái)的動(dòng)態(tài)GO富集分析，篩選出P<0.001的GO條目322個(gè)，其中生物過程(biology process)276個(gè)，分子功能(molecular function)22個(gè)，細(xì)胞組成(cellular componet)24個(gè)。如圖4所示，生物過程主要包括刺激反應(yīng)、生物過程調(diào)節(jié)與控制、細(xì)胞代謝過程、信號(hào)傳導(dǎo)等；分子功能包括結(jié)合、催化、調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組成包括細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞膜等。進(jìn)一步富集GO條目，發(fā)現(xiàn)其主要聚集在細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位調(diào)節(jié)、氮化合物代謝過程正調(diào)控等方面(圖5)，說明蟲草素的抗癌作用主要與這些生物過程有關(guān)。

圖4 蟲草素抗癌靶點(diǎn)的GO功能分析

圖5 蟲草素抗癌靶點(diǎn)的GO功能富集

2.4抗癌靶點(diǎn)的KEGG通路分析依據(jù)P<0.05篩得蟲草素抗癌靶點(diǎn)KEGG通路20條(表2)，圖6為各通路富集氣泡圖，靶點(diǎn)比率(GeneRatio)是蟲草素富集在通路下的靶點(diǎn)與該通路所有蛋白的比值，比值越大表明富集程度越高。顏色表示P值，越紅表示P值越小，富集越顯著。點(diǎn)的大小表示該通路富集靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)，點(diǎn)越大表示富集的個(gè)數(shù)越多。由圖可知，靶點(diǎn)比率較大的通路包括鉑耐藥、細(xì)胞凋亡、p53等，其中鉑耐藥通路富集的靶點(diǎn)最多，靶點(diǎn)比率最高，且P值最小。由圖7的鉑耐藥通路圖可見，蟲草素激活p53，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例，作用于Caspase家族的CASP9、CASP8、CASP3，以及AKT和p21，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

表2 KEGG信號(hào)通路信息

圖6 蟲草素抗癌靶點(diǎn)的通路富集氣泡圖

注：紅色標(biāo)記代表蟲草素富集在鉑耐藥通路的靶點(diǎn)圖7 鉑耐藥通路

2.5蟲草素與抗癌主要靶點(diǎn)的分子對(duì)接由表3可知，6個(gè)靶蛋白與蟲草素親和力均<-5 kcal/mol，其中半胱氨酸蛋白酶-3(圖8)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(圖9)及RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(圖10)的親和力最高，分別為-9.1、-7.1、-7.0 kcal/mol，它們與蟲草素對(duì)接的氨基酸殘基如表4所示。

表3 蟲草素與6個(gè)主要靶點(diǎn)的分子對(duì)接

表4 靶點(diǎn)與蟲草素對(duì)接的氨基酸殘基

圖8 半胱氨酸蛋白酶-3的分子對(duì)接模型

圖9 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1的分子對(duì)接模型

圖10 RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的分子對(duì)接模型

3 討論

生物堿是存在于植物、真菌、細(xì)菌等有機(jī)體內(nèi)的一類堿性含氮化合物，具有生物學(xué)活性[7]。以往發(fā)現(xiàn)的紫杉醇、喜樹堿、長(zhǎng)春堿等抗癌明星藥都屬于生物堿，大多數(shù)生物堿能夠抑制癌細(xì)胞有絲分裂、阻滯細(xì)胞周期及增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬等，是最具潛力的抗癌藥物發(fā)掘地[8-10]。蟲草素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與腺苷相似，它可以取代腺苷參與癌細(xì)胞的代謝過程，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，以蟲草素為主要活性成分的新藥已在白血病的臨床中試用[11]。

本研究檢索多個(gè)化合物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)、疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘出31個(gè)蟲草素抗癌靶點(diǎn)。通過靶點(diǎn)的蛋白互作分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)主要靶點(diǎn)，分別為調(diào)控癌細(xì)胞凋亡的TP53、CASP3、BCL2L1、XIAP，調(diào)控細(xì)胞增殖的AKT1，以及調(diào)控細(xì)胞周期的CDKN1A，說明蟲草素主要通過調(diào)控癌細(xì)胞凋亡、增殖及周期運(yùn)行來(lái)發(fā)揮抗癌作用。將6個(gè)主要靶點(diǎn)與蟲草素進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果親和力均<-5kcal/mol，說明它們易結(jié)合，可能是蟲草素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。Ying等[12]研究表明蟲草素通過提高膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中p53及磷酸化p53水平誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡。鄭慶委等[13]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制人舌癌TCA-8113細(xì)胞增殖而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Xu等[14]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素通過激活Caspase級(jí)聯(lián)凋亡信號(hào)，調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞ECA-109染色質(zhì)濃縮，顯著增加凋亡細(xì)胞數(shù)量。研究還發(fā)現(xiàn)蟲草素分別下調(diào)人宮頸癌Hela細(xì)胞[15]和人骨肉瘤MG63細(xì)胞[16]中凋亡抑制蛋白Bcl-2，并上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展，增進(jìn)細(xì)胞早期凋亡。劉雯思等[17]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素對(duì)人腎癌細(xì)胞ACHN有顯著的抑制作用，誘導(dǎo)人腎癌細(xì)胞ACHN凋亡，其可能的機(jī)制是抑制AKT蛋白的磷酸化，從而抑制AKT通路活化。Lee等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能夠降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7的XIAP表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

目前，超過50%的化療方案涉及鉑類藥物的使用，其中FDA批準(zhǔn)的順鉑、卡鉑和奧沙利鉑是癌癥臨床化療方案中的支柱藥物，它們主要通過與癌細(xì)胞DNA的相互作用引起癌細(xì)胞凋亡[19]。雖然鉑類藥物能夠治療多種癌癥，但對(duì)鉑類藥物耐藥已成為癌癥化療失敗的主要原因[20]。鉑類藥物耐藥機(jī)制有多種，包括癌細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少、鉑類藥物失活、DNA的自我修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡等；其中抑制細(xì)胞凋亡與抑癌蛋白p53、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、XIAP表達(dá)密切相關(guān)[21]。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)蟲草素富集最顯著的信號(hào)通路是鉑耐藥，在此通路中蟲草素激活p53，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例，作用于Caspase家族的CASP9、CASP8、CASP3，以及AKT和p21，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡而逆轉(zhuǎn)其鉑耐藥。羅俊等[22]研究證實(shí)與順鉑單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合蟲草素后食管癌細(xì)胞ECA-109的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，而促凋亡蛋白Bax則顯著增高，順鉑對(duì)ECA-109細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)明顯增強(qiáng)。張超等[23]也發(fā)現(xiàn)蟲草素能夠調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549對(duì)順鉑的敏感性。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)順鉑和蟲草素聯(lián)合給藥后，人口腔癌OC3細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)。