γ-干擾素誘導的溶酶體硫醇還原酶在膠質瘤中的表達及其與膠質瘤化療耐藥關系

陳三送，姚 林，王其福，邵雪非，程禮敏

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院 形態(tài)學實驗實訓中心，安徽 蕪湖 241002)

γ-干擾素誘導的溶酶體硫醇還原酶(lysosomal thiol reductase，GILT)，基因名稱：IFI30，在許多抗原呈遞細胞如B細胞、骨髓來源的樹突狀細胞和單核-巨噬細胞中組成型表達[1-3]，負責催化抗原中二硫鍵的還原。研究發(fā)現(xiàn)GILT在黑色素瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、乳腺癌中差異表達，影響疾病預后[4-6]。但其在膠質瘤中的表達情況及其與膠質瘤預后的關系報道較少。本研究旨在探討GILT在膠質瘤中表達情況及其與膠質瘤化療耐藥之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究分析了CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)325例膠質瘤患者以及TCGA數(shù)據(jù)庫中非瘤腦組織207例、較低級別膠質瘤518例、膠質母細胞瘤163例中GILT相關數(shù)據(jù)信息。

1.2 臨床標本 選用弋磯山醫(yī)院神經(jīng)外科手術后獲取的膠質瘤組織標本進一步驗證GILT的蛋白表達。其中低級別膠質瘤10例，膠質母細胞瘤10例。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準，所有入選受試者或受試者家屬均簽署知情同意書，同意參與該項目，受試者信息予以嚴格保密。

1.3 免疫組化檢測 按照免疫組化試劑說明書，先將切片脫蠟、抗原修復，再用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。血清封閉后，加入一抗4°C孵育過夜。洗滌后，加入二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色后，復染細胞核，脫水封片。顯微鏡鏡檢，采集圖像。陽性判定標準：在細胞漿及細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。光鏡下隨機觀察8個高倍視野，記錄染色陽性的百分率。

2 結果

2.1 GILT在膠質瘤組織中高表達且與WHO分級、IDH突變、1 p/19 q聯(lián)合缺失相關 TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示GILT在較低級別膠質瘤(LGG)、膠質母細胞瘤(GBM)中表達均高于非瘤腦組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)分析顯示GILT在WHO Ⅱ～Ⅳ級中隨著腫瘤級別增高，表達也逐級增高，且在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中(WHO Ⅱ級除外)表達分別高于IDH突變型及1 p/19 q聯(lián)合缺失型(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2 GILT在膠質瘤中高表達與生存期的關系 CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)分析顯示所有級別膠質瘤中不管是原發(fā)還是復發(fā)患者，GILT高表達者生存期更短、預后更差(見圖2)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 免疫組化檢測臨床膠質瘤標本中GILT蛋白的表達情況 結果顯示GILT在低級別及高級別膠質瘤中均明顯高表達(見圖3)，與TCGA、CGGA數(shù)據(jù)庫分析結果一致。

表1 GILT在膠質瘤中的表達及與WHO分級、IDH突變、1 p/19 q聯(lián)合缺失的關系

A.TCGA數(shù)據(jù)庫中GILT在膠質瘤及非瘤腦組織中的相對表達情況；b.CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)中GILT在WHO Ⅱ～Ⅳ級中的相對表達情況；c、d.CGGA數(shù)據(jù)庫中GILT在IDH野生型及突變型膠質瘤組織中的相對表達情況；e、f.CGGA數(shù)據(jù)庫中GILT在1 p/19 q聯(lián)合缺失型及非缺失型膠質瘤組織中的相對表達情況。

2.4 GILT表達與化療耐藥基因之間的關系 CGGA數(shù)據(jù)庫(mRNAseq_325)結果顯示，在原發(fā)和復發(fā)膠質瘤患者中，GILT的表達與經(jīng)典的化療耐藥基因MGMT、ERCC1、ERBB2的表達均成正相關，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表3。

a b

表2 不同GILT表達的膠質瘤患者生存時間對比分析

a、b.低級別膠質瘤；c、d.高級別膠質瘤。棕黃色示陽性表達。

表3 GILT與MGMT、ERCC1、ERBB2表達的相關性

3 討論

有研究報道GILT在抗原提呈及加工過程中起重要作用[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其差異表達與黑色素瘤、彌漫性大B淋巴瘤、乳腺癌等預后相關[4-6]。然而，其在膠質瘤中的表達情況及與預后的關系，相關報道不多。

TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫為膠質瘤的研究提供了豐富、可靠的基因組數(shù)據(jù)。筆者通過分析該數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)GILT在膠質瘤中高表達，且表達與WHO分級呈正相關。其在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中表達分別高于IDH突變型及1 p/19 q聯(lián)合缺失型。研究已經(jīng)證實IDH突變，尤其是IDH1突變顯著影響膠質瘤對化療敏感度。IDH1突變型患者化療效果較IDH1野生型好[8-9]。1 p和19 q聯(lián)合缺失是膠質瘤，特別是少枝膠質細胞瘤預后的重要分子指標。1 p/19 q聯(lián)合缺失與膠質瘤化療敏感度相關[10]。1 p/19 q聯(lián)合缺失者對含烷化劑的PCV方案及TMZ更敏感，具有較好的預后[11-12]。然而，本研究中我們發(fā)現(xiàn)GILT在IDH野生型、非1 p/19 q聯(lián)合缺失型中表達更高。這提示GILT高表達患者的化療敏感度更差。CGGA數(shù)據(jù)庫中生存分析結果也佐證了這一結果。CGGA(mRNAseq_325)數(shù)據(jù)庫生存時間分析發(fā)現(xiàn)：不管是原發(fā)還是復發(fā)膠質瘤患者，GILT高表達者均具有明顯短的生存時間。以上結果表明膠質瘤中GILT高表達與化療敏感度及預后相關。

GILT是否也與膠質瘤化療耐藥相關？為此，我們分析了GILT與經(jīng)典的化療耐藥基因MGMT、ERCC1、ERBB2之間的關系。MGMT屬于一種DNA烷基化損傷修復酶，通過將O6-甲基鳥嘌呤轉移到自身半胱氨酸殘基上，從而抵抗烷化劑的細胞毒作用，導致腫瘤細胞耐藥[13]。ERCC1是核苷酸切除修復系統(tǒng)中一員，主要完成DNA交聯(lián)形成后的切除修復過程[14]，其主要與氮芥類、順鉑的耐藥相關[15]。ERBB2編碼的穿膜受體樣蛋白，是上皮生長因子受體家族中的一員，其高表達與環(huán)磷酰胺、阿霉素、5氟脲嘧啶的耐藥有關[16-17]。以上3種基因屬于不同作用機制的耐藥基因，CGGA數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)均與GILT表達呈正相關(P<0.05)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤化療耐藥基因還有很多，以上3種基因相關性分析尚不足以說明GILT表達與膠質瘤化療耐藥直接相關，但提示GILT可能與化療耐藥相關，可以為進一步體內(nèi)外實驗驗證提供線索。

筆者通過臨床膠質瘤標本同樣證實了GILT在膠質瘤中高表達，結果與數(shù)據(jù)庫分析吻合。至于GILT通過何種機制促進膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展及與耐藥相關，本課題組正在進行下一步研究，希望能為將來膠質瘤的治療提供新思路。