杜鵑花總黃酮通過激活大鼠腦基底動脈血管內皮細胞TRPV4、Kca3.1和Kca2.3通道改善缺血性腦損傷

王書凡,赫玉香,程小龍，徐杭杭，沈學彬,，胡浩然,，周若瑜,,3，曹 迪,,3，韓 軍,,3,4

(皖南醫(yī)學院 1.安徽省皖南地區(qū)植物藥活性物質篩選與再評價工程實驗室；2.藥物研發(fā)中心；3.安徽省多糖藥物工程技術研究中心；4.藥理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

腦血管疾病是一種發(fā)病率高、致殘率高、病死率高的疾病[1-2]。缺血性腦血管疾病由于供應腦血流的主動脈狹窄或閉塞，致腦組織缺氧缺血，引發(fā)局部腦組織的缺血甚至壞死[3]。發(fā)病后，應盡快恢復缺血組織血流，但再灌注又會引起更嚴重的腦損傷[4-5]。其病理過程復雜，機制尚不清楚。

腦血管收縮和舒張因子引起的血管張力變化是缺血性腦血管病變化、發(fā)展及轉歸的關鍵因素。血管內皮衍生超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF)可由腦血管內皮細胞合成釋放，促進血管內皮細胞鈣激活鉀通道(calcium-activated potassium channel，Kca),引起平滑肌細胞超極化，繼而導致Ca2+內流減少，產生血管松弛作用[6]。瞬時受體電位通道4(transient receptor potential vanilloid channel 4，TRPV4)是存在于細胞膜上的非選擇性陽離子通道，可調節(jié)血管功能。在血管內皮細胞中，激活TRPV4可促使Ca2+內流，進而開放中電導鈣激活鉀通道(intermediate conductance Kca，Kca3.1)和小電導鈣激活鉀通道(small conductance Kca，Kca2.3)，促進EDHF誘導的血管松弛反應[6]。

杜鵑花是杜鵑花科植物，含槲皮素、映山紅素、蘆丁、金絲桃苷等成分[7]，有止咳、平喘、祛風濕等功效。杜鵑花總黃酮(total flavone of rhododendron，TFR)是從杜鵑花中提取的一種化合物[6]。研究發(fā)現，TFR可減少腦梗死面積和缺氧復氧損傷神經元內Ca2+濃度，減輕腦水腫[6]。前期研究表明[6-7]，在全腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)大鼠腦基底動脈(cerebral basilar artery，CBA)中，TFR減輕缺血性腦損傷的保護作用可能與其激活血管內皮細胞和平滑肌細胞中TRPV4有關。但TFR是否通過激活TRPV4繼而開放Kca3.1、Kca2.3通道產生保護作用，未見相關報道。

本研究建立IR大鼠模型，研究TFR改善缺血性腦損傷的保護作用與CBA血管內皮細胞TRPV4、Kca2.3及Kca3.1通道之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑 TFR(≥85%)、HC-067047(批號：SML0143)、TRAM-34(批號：T6700)和Apamin(批號：A9459)，購于上海源葉生物科技有限公司；Rat LDH Elisa kit(批號：CK-E30024)和Rat MDA Elisa kit(批號：CK-E30266R)，購自蘇州卡爾文生物科技有限公司。

1.2 儀器 BL-310生物機能試驗儀(成都泰盟科技有限公司)，腦立體定位儀(美國哈佛公司)，逆轉錄PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 動物 72只雄性SD大鼠(8 周齡)，(250±20) g，南京青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2014-0001。相對濕度55%～60%，室溫(23±2)℃，自由飲食進水，適應性喂養(yǎng)1周。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與給藥 72只SD雄性大鼠，除假手術組，其余建立IR模型。隨機分9組：假手術組、模型組、TFR組(100 mg/kg)、TFR聯用HC-067047組(100 mg/kg +10 mg/kg)、TFR聯用TRAM-34組(100 mg/kg +0.5 mg/kg)、TFR聯用Apamin組(100 mg/kg +0.3 mg/kg)、HC-067047組(10 mg/kg)、TRAM-34組(0.5 mg/kg)及Apamin組(0.3 mg/kg)。上述藥物術前30 min或 35 min于尾靜脈注射。

1.4.2 Pulsinelli-Brierley四血管阻斷法(four-vessel occlusion，4-VO)[3]大鼠腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，頸后正中切口2 cm，電凝頸椎兩側翼孔，阻斷兩側椎動脈，縫合。24 h 后麻醉，分離左右兩側頸總動脈，阻斷兩側頸總動脈25 min，再灌注2 h。以大鼠可自主呼吸，翻正反射消失，腦電波低平為造模成功標志。假手術組不阻斷雙側椎動脈和頸總動脈，其余操作相同。

1.4.3 ELISA法檢測血清丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)含量與乳酸脫氫酶(lumbar disc herniation，LDH)活性 大鼠麻醉后，腹主動脈取血，分離血清后按試劑盒說明書檢測血清中MDA含量與LDH活性。

1.4.4 HE染色 再灌注24 h后，處死大鼠，取腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中。經脫水、浸蠟、包埋，切片、脫蠟、染色，顯微鏡觀察各組病理學變化。

1.4.5 RT-qPCR法[3]免疫磁珠法分離腦基底動脈內皮細胞[8]，總RNA的提取按照Trizol一步法的說明書，純化定量后，取2 μg總RNA逆轉錄合成cDNA(37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)，置于-20 ℃冰箱。按Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書擴增RT-PCR基因片段(95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s)，共40個循環(huán)，GAPDH為內參。采取7300 System SDS Software分析，算出每組RQ值及△△Ct值，分析每組mRNA表達情況。GAPDH，上游：5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，下游：5′-CACAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；Kca3.1引物，上游：5′-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3′，下游：5′-TGC-

TAAGCAGCTCAGTCAGGG-3′；Kca2.3引物，上游：5′-CACCTTCCCCAAAGCCAACA-3′，下游：5′-CGATCACAAAGAGCTGTACTTCC-3′；TRPV4引物，上游：5′-CCCGA GAGAACACCAAGTTTG-3′，下游：5′-GA-

CCGTCATTGTTAAGCACAGTCT-3′。

2 結果

2.1 大鼠血清MDA含量和LDH活性 模型組MDA含量及LDH活性較假手術組升高(P<0.05)。與模型組相比，TFR組及TFR聯用各阻斷劑組MDA含量及LDH活性降低(P<0.05)。與TFR組比較，TFR聯用各阻斷劑組MDA含量及LDH活性升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組IR大鼠血清MDA含量和LDH活性比較

2.2 HE染色結果 與假手術組相比，模型組大鼠可見大量腦組織出現細胞萎縮、空泡，神經纖維崩解等。而TFR組大鼠腦組織病理學改變明顯改善。TFR聯用各阻斷劑組細胞變性壞死仍較明顯，細胞周圍間隙明顯增大，但較模型組改善明顯。見圖1。

2.3 TFR及各阻斷劑對IR大鼠CBA內皮細胞中TRPV4、Kca3.1、Kca2.3 mRNA表達水平的影響 與假手術組相比，模型組TRPV4、Kca3.1及Kca2.3 mRNA表達下降(P<0.05)。與模型組相比，TFR組及TFR聯用各阻斷劑組TRPV4、Kca3.1及Kca2.3 mRNA表達水平升高(P<0.05)，HC-067047組TRPV4 mRNA表達水平下調(P<0.05)，Apamin組和TRAM-34組TRPV4 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與TFR組相比，TFR聯用各阻斷劑組與各阻斷劑組TRPV4、Kca3.1及Kca2.3 mRNA表達下降(P<0.05)。與TFR聯用各阻斷劑組相比，各阻斷劑組TRPV4、Kca3.1及Kca2.3 mRNA表達下調(P<0.05)。見表2～4。

A.假手術組；B.模型組；C.TFR組；D.TFR+HC-067047組；E.TFR+Apamin組；F.TFR+TRAM-34組。

表2 TFR及HC-067047對內皮細胞中TRPV4 mRNA表達的影響

表3 TRAM-34對內皮細胞中 Kca3.1 mRNA表達的影響

表4 TFR及Apamin對內皮細胞中 Kca2.3 mRNA表達的影響

3 討論

缺血性腦血管疾病是一種常見的神經系統(tǒng)疾病[8]，其機制復雜，目前臨床上尚無療效確切的藥物。我們的前期研究已證實TFR(100 mg/kg)可產生EDHF樣舒張腦血管、改善腦組織病理損傷等作用[6]。

瞬時受體電位通道(TRP)是Ca2+進入內皮細胞的非選擇性陽離子通道[9]。瞬時受體電位通道亞家族V(TRPV)是TRP通道的亞科，TRPV4是TRPV的成員，參與細胞增殖、分化與凋亡等。文獻報道，激活TRPV4能改善缺血性腦損傷[8]。前期研究發(fā)現，TFR預處理后，IR大鼠CBA內皮細胞中TRPV4 蛋白表達明顯升高，而此作用可以被TRPV4通道非選擇性阻斷劑(釕紅)抑制。提示TFR可能通過激活TRPV4改善腦組織損傷，但具體機制尚不明確[6]。研究證實，平滑肌細胞膜上Ca2+與K+通道可調節(jié)血管舒縮功能。平滑肌細胞膜K+通道[10-11]分為Ca2+激活K+通道(Kca)、內向整流K+通道(Kir)、ATP依賴型K+通道 (KATP)及延遲整流K+通道(Kdr)。Kca對Ca2+濃度敏感，通過負反饋調節(jié)，影響胞內Ca2+濃度，調節(jié)血管舒縮功能。目前已知Kca有3種亞類[10]：大電導Kca(BKca)、Kca3.1及Kca2.3。心腦血管疾病與這3類Kca聯系緊密。其中BKca主要分布在平滑肌及某些神經元；Kca3.1分布廣泛，如紅細胞、血小板、上皮細胞、血管內皮細胞；Kca2.3在心房肌細胞的胞膜、胞質及胞核均有分布，血管內皮細胞中亦存在。通過抑制Kca3.1的表達，可減弱由乙酰膽堿激活的內皮依賴性超極化反應，減弱血管舒張功能[12]。阻斷Kca2.3則減小阻力血管直徑，恢復Kca2.3活性時，此現象消失[13]。敲除Kca3.1與Kca2.3兩種基因，可減少巨噬細胞浸潤，降低氧化應激[14]。

當腦組織缺血缺氧時，乳酸累積，血清中LDH活性升高加快分解乳酸[15]，不飽和脂肪酸和氧自由基可合成釋放MDA[16]。因此檢測血清中LDH活性和MDA含量可間接反映缺血腦組織損傷程度。HC-067047、Apamin和TRAM-34分別是TRPV4[17]、Kca2.3和Kca3.1選擇性阻斷劑[18]。本實驗發(fā)現用藥TFR后，IR大鼠血清中MDA含量升高及LDH活性下降，腦組織病理損傷改善。而分別加入各相應阻斷劑后，以上TFR的作用被抑制。提示TFR的作用可能與其開放TRPV4、Kca3.1、Kca2.3有關。RT-qPCR結果顯示，用藥TFR后，IR大鼠CBA內皮細胞中降低的TRPV4、Kca3.1和Kca2.3 mRNA表達升高。而各相應選擇性阻斷劑可抑制TFR的此作用，提示TFR改善大鼠腦組織損傷的作用可能與其激活CBA內皮細胞中TRPV4、Kca2.3及Kca3.1，促進其 mRNA表達有關。研究表明，開放TRPV4可產生EDHF效應并激活Kca3.1和Kca2.3[19]。因此，在IR大鼠CBA內皮細胞中，TFR可能通過激活TRPV4，促進其下游Kca2.3、Kca3.1基因表達，改善缺血性腦損傷。

綜上所述，結合前期研究[6-8]可知，缺血性腦損傷發(fā)生時，CBA內皮細胞TRPV4受到抑制導致下游Kca3.1與Kca2.3功能與活性降低，腦血管舒張功能減弱，腦血流降低，血清中LDH活性與MDA含量升高。用藥TFR后，其作用于CBA內皮細胞激活TRPV4，繼而開放Kca2.3與Kca3.1，促進內源性舒血管物質EDHF生成增多，誘導CBA舒張，降低MDA含量與LDH活性，減輕大鼠IR損傷。