不同采收期對(duì)月季花總黃酮含量及其抗氧化活性的影響

上官琨瑤,黃秀秀,宋 庸,張曉婷,潘 斐,劉怡晨,蔣萬(wàn)里,錢慧琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000)

月季花(Rosae Chinensis Flos)是薔薇科薔薇屬月季(RosachinensisJacq)的干燥花。味甘,性溫,歸肝經(jīng),具有活血調(diào)經(jīng),疏肝解郁之效,臨床上常用于氣滯血瘀,月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng),閉經(jīng),胸脅脹痛等病癥的治療[1],亦可用于冠狀動(dòng)脈性心臟病、頸淋巴結(jié)炎、肺虛咳嗽咯血、產(chǎn)后陰挺等病癥的治療[2]。研究發(fā)現(xiàn),月季花活性成分有黃酮類、酚酸類、芳香油、鞣質(zhì)和色素[3-4]等,其中,以黃酮類化合物中槲皮素及其苷類為其主要活性成分[5-6],具有抗氧化[7-9],抗腫瘤[10-11],抗菌[12],抗衰老[13],提高機(jī)體免疫[14]等作用[15-16]。

黃酮類化合物是藥用植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,不同采收期與其次生代謝產(chǎn)物的積累有密切聯(lián)系[17]。藥材能否發(fā)揮較好的臨床療效以及評(píng)價(jià)其質(zhì)量的好壞主要取決于其活性成分[18]。目前,薛紫鯨等[19]采用紫外-可見分光光度法測(cè)定不同采收期祁艾的總黃酮和總酚酸含量,發(fā)現(xiàn)祁艾在不同采收期內(nèi)黃酮和酚酸的含量有較大的差異,經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)端午節(jié)前后祁艾有效成分含量最高,最終確定祁艾的最佳采收期。此外,付士朋等[20]測(cè)定不同采收期芍藥中有效成分含量,并探究其含量與采收期之間的變化規(guī)律。月季花的研究多局限在黃酮含量測(cè)定及提取工藝方面,但關(guān)于月季花在不同的采收期其有效成分是否有較大的差異尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以2019年4月中旬至11月中旬采收的月季花為研究對(duì)象,測(cè)定不同采收期月季花總黃酮含量,并以其清除DPPH·、羥基自由基的能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性,探究其總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性,最終確定月季花最佳采收期,為其資源的開發(fā)、臨床應(yīng)用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

月季花 采集于河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院校園內(nèi),經(jīng)閆福林教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物月季;蘆丁對(duì)照品 純度98%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;L-抗壞血酸(VC) 上海源葉生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、石油醚、乙酸乙酯 分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

ME203E/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;101-3ES型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;CAA-420型低溫冷卻水循環(huán)泵 鄭州杜甫儀器廠;T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 月季花預(yù)處理 將2019年4月中旬-11月中旬(表1)的月季花清洗干凈,晾曬至干燥,粉碎,過(guò)60目篩,分別置于密封袋中保存,備用。

表1 月季花樣品信息

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁母液 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分別置于10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法顯色,分別加入5% NaNO20.4 mL,搖勻,6 min后加入10% Al(NO3)30.4 mL,搖勻,6 min后再加入4% NaOH 溶液4 mL,蒸餾水定容至刻度,15 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定不同濃度蘆丁的吸光度A[21]。以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)得線性回歸方程y=1.8109x-0.0561,決定系數(shù)R2=0.9998。

1.2.3 供試品溶液的制備 參照錢慧琴等[22]的提取方法制備供試液,精密稱取不同采收期月季花粉末2 g,按液料比42∶1 mL/g加入60%乙醇溶液,于87 ℃下加熱回流提取85 min,過(guò)濾,濾液于55 ℃減壓濃縮至無(wú)醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯部位減壓濃縮至浸膏,加無(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容至刻度,即得月季花供試品溶液。

1.2.4 月季花總黃酮含量的測(cè)定 精密吸取不同采收時(shí)期月季花供試品溶液1.00 mL,置10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法顯色,于510 nm處測(cè)定月季花供試品溶液的吸光度。不同采收期月季花總黃酮的含量的按式(1)計(jì)算。其中,供試品溶液的濃度按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算。

式(1)

式中:Y為月季花總黃酮含量,mg/g;C為月季花總黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為測(cè)量總黃酮提取液體積，mL;N為稀釋倍數(shù);M為月季花干品質(zhì)量,g。

1.2.5 月季花不同采收期抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.5.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定 參照閆蕊等[23]的方法并加以修改,將不同采收期月季花供試品溶液配成 2、8、14、20、26、32、40、50 μg/mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液置于試管中,加入質(zhì)量濃度為2.55×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液(臨用現(xiàn)配)2 mL,搖勻,避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A1。同時(shí)測(cè)定2 mL樣品溶液和2 mL無(wú)水乙醇的吸光度A2,2 mL無(wú)水乙醇和2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度A0。以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為對(duì)照組。根據(jù)式(2)計(jì)算DPPH·清除率,即:

式(2)

式中,W表示DPPH·清除率,A1表示加入樣品的吸光度,A2表示樣品參比溶液的吸光度,A0表示未加樣品的吸光度。

表2 不同采收期月季花提取物中的總黃酮含量(n=3)

1.2.5.2 清除羥基自由基(OH·)能力測(cè)定 參照張春生等[24]的方法并加以修改,配制不同質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.2、1.5 mg/mL的月季花樣品溶液,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液各1 mL,再加入4 mL 20 mmol/L H2O2溶液,搖勻,37 ℃水浴下反應(yīng)30 min,于510 nm處測(cè)定吸光度A1;同時(shí)測(cè)定等體積的去離子水代替H2O2溶液的吸光度A2;測(cè)定等體積的乙醇溶液代替樣品溶液的吸光度A0。以相同質(zhì)量濃度的 VC溶液作為對(duì)照組。根據(jù)式(3)計(jì)算OH·清除率,即:

式(3)

式中,W表示OH·清除率,A1表示加入樣品的吸光度,A2表示樣品參比溶液的吸光度,A0表示未加樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 20.0及Excel進(jìn)行圖表的繪制及數(shù)據(jù)的處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期月季花中黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

由表2所示,不同采收期的月季花中總黃酮含量是呈動(dòng)態(tài)變化的,4月中旬至9月中旬,隨著采收期的延長(zhǎng),月季花中總黃酮的含量呈現(xiàn)下降而又驟然上升的趨勢(shì);9月中旬至11月中旬,月季花總黃酮含量緩慢下降趨于平緩。其中,4月中旬月季花總黃酮含量最高,為(152.28±1.69) mg/g,5月中旬月季花總黃酮含量次之,為(147.11±1.05) mg/g。8月中旬時(shí)月季花總黃酮含量最低,為(106.54±2.00) mg/g。一般認(rèn)為黃酮的積累與植物的生長(zhǎng)期、溫度和水分有關(guān)[19]。4月總黃酮最高可能因?yàn)樵录净ㄉ形赐耆_放,且生長(zhǎng)溫度較低,越冬芽發(fā)育的早期幼苗生長(zhǎng)較慢,黃酮積累較豐富有關(guān)。8月月季花總黃酮最低可能是由于該時(shí)期花已經(jīng)完全開放,且天氣炎熱,降雨量多,作物生長(zhǎng)較快,黃酮積累較少有關(guān)。

2.2 不同采收期月季花的抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.2.1 清除DPPH·能力 由圖1可知,在質(zhì)量濃度2～50 μg/mL范圍內(nèi),隨著不同采收期的月季花總黃酮溶液和陽(yáng)性對(duì)照VC質(zhì)量濃度的增大,對(duì)DPPH·清除率逐漸增強(qiáng)而趨于平衡。通過(guò)SPSS 20.0軟件計(jì)算不同采收期月季花總黃酮溶液和VC對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率IC50,如圖2所示。7月、8月采收的月季花所含總黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率(IC50=1.792,2.772 μg/mL)明顯低于VC(IC50=4.806 μg/mL),說(shuō)明7月、8月采收的月季花所含總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力高于VC,其中7月份月季花總黃酮對(duì)DPPH·清除能力最強(qiáng)。4～6月、9～11月采集月季花的總黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率IC50均高于VC,說(shuō)明此時(shí)抗氧化活性均弱于VC。由此可見,不同采收期的月季花總黃酮含量呈現(xiàn)出不同程度的清除DPPH·的能力,表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性,這可能是因?yàn)樵录净ㄔ诓煌墒掌邳S酮類成分積累雖存在較大差異,但是黃酮類成分的結(jié)構(gòu)不同,所起到的抗氧化活性不相同[25-26],對(duì)月季花的抗氧化活性也有一定程度的影響。

圖1 不同采收期月季花總黃酮對(duì)DPPH· 的清除能力

圖2 不同采收期月季花總黃酮對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率IC50

2.2.2 清除羥基自由基能力 由圖3所示,不同采收期月季花總黃酮對(duì)OH·的清除能力隨著樣品和VC質(zhì)量濃度的增加而不斷的增強(qiáng),體現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系。不同采收期月季花總黃酮溶液和VC對(duì)OH·的半數(shù)清除率IC50如圖4所示,不同采收期的月季花總黃酮對(duì)OH·的半數(shù)清除率均高于VC,說(shuō)明不同采收期的月季花總黃酮對(duì)OH·清除能力均弱于VC,但依然表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。在月季花不同采收期中,7月份月季花總黃酮清除OH·的能力最強(qiáng),這與上述清除DPPH·的結(jié)果是一致的。

2.3 抗氧化活性與總黃酮含量相關(guān)性分析

由表3可知,不同采收期月季花總黃酮含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)范圍為0.8000～0.9842,除了11月份呈顯著相關(guān)(P<0.05)外,其他月份均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01);不同采收期月季花總黃酮與OH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)范圍為0.9639～0.9947,均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01),因此可以推斷月季花總黃酮含量與其抗氧化活性均呈一定的相關(guān)性,總黃酮含量越高,抗氧化活性越高,黃酮的含量是影響月季花抗氧化活性的重要因素。

表3 不同采收期的月季花提取物中總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

圖3 不同采收期月季花總黃酮對(duì)OH·的清除能力

圖4 不同采收期月季花總黃酮對(duì)OH·的半數(shù)清除率IC50

3 討論與結(jié)論

本研究以不同采收期月季花為研究對(duì)象,比較其總黃酮含量和抗氧化活性。結(jié)果表明,月季花總黃酮含量不同的采收期內(nèi)其含量差異很大,其含量變化為:4月份>5月份>9月份>10月份>11月份>6月份>7月份>8月份。4月份采收的月季花總黃酮含量最高,8月份采收的月季花總黃酮含量最低。月季花總黃酮含量表現(xiàn)出明顯的季節(jié)規(guī)律性,在春季和秋季含量比較高,尤其是在春季,含量最高。月季花總黃酮含量的波動(dòng)主要與其生長(zhǎng)周期,生長(zhǎng)環(huán)境,采收次數(shù),初采時(shí)間,采收間隔時(shí)間等[27]因素有關(guān)。這一結(jié)果與薛紫鯨等[19]不同采收期祁艾化學(xué)成分差異性研究結(jié)果相一致。

體外抗氧化活性研究結(jié)果顯示7月份采收的月季花總黃酮清除DPPH自由基和OH自由基的能力最強(qiáng)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,月季花總黃酮含量與其抗氧化活性均具顯著相關(guān)性,但是體外抗氧化活性試驗(yàn)顯示月季花的抗氧化活性與總黃酮含量不是正相關(guān)的。這可能是由于在不同采收期中月季花積累的黃酮的結(jié)構(gòu)不同,發(fā)揮的抗氧化活性有一定差異,另外在提取過(guò)程中,若溫度過(guò)高會(huì)造成黃酮結(jié)構(gòu)的破壞,促進(jìn)其他雜質(zhì)的溶出,從而影響其抗氧化活性。

綜合考慮,4月份月季花總黃酮含量最高,若此時(shí)采摘將影響月季的生長(zhǎng),且抗氧化試驗(yàn)表明4月的抗氧化活性并不是最高的。7月份采摘月季花其抗氧化活性最高,藥用價(jià)值較高,故以7月份采摘月季花的最佳時(shí)期。另外相關(guān)性分析顯示,月季花總黃酮是其抗氧化的主要活性成分,但其具體的黃酮物質(zhì)的組成和含量以及其他雜質(zhì)對(duì)于抗氧化活性關(guān)系仍需進(jìn)一步分析和完善。