響應(yīng)面法優(yōu)化野金柴總黃酮超聲輔助提取工藝及其不同組分抗氧化能力研究

李洪安,李夏嘉龍,鄧澤元,江和棟,李紅艷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

野金柴,是殼斗科櫟屬植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥葉[1],又名多穗柯。廣泛分布于長江南部,尤以江西、福建、湖南、廣西等省最為廣泛[2]。野金柴中富含黃酮類化合物[3],其中,根皮苷具有強烈的甜味,甜度可達蔗糖的300倍[4],一般應(yīng)用于生產(chǎn)茶飲料,根皮苷有較高的抗氧化能力[5],在食品生產(chǎn)中有較高的利用價值。金弘昕等[6]對野金柴的化學(xué)組分進行了分離鑒定,研究表明,野金柴黃酮類物質(zhì)除根皮苷外,還有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羥基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷幾種黃酮化合物,未對其活性進行進一步研究;單思聰?shù)萚7]的研究表明,多穗柯總黃酮具有較好的抗氧化能力,陳陽[8]的研究證實多穗柯根皮苷具有一定的抗氧化作用。但目前除根皮苷外,尚未見關(guān)于野金柴中其他黃酮類化合物研究利用的報道。

目前,對于野金柴中黃酮類化合物的提取,大多采用加熱回流、長時間浸提等方法,但此類方法存在提取時間長、效果不佳、消耗溶劑量大等缺點,提取時的高溫還可能破壞野金柴中的功能性成分。相比之下,超聲輔助提取具有高效、消耗溶劑量小、綠色環(huán)保等優(yōu)點[9]。超聲波在液體介質(zhì)中能產(chǎn)生空化效應(yīng),能有效地破壞包埋結(jié)構(gòu)的外層,加速功能成分的溶出,從而提高提取效率。在超聲提取過程中,液料比、乙醇濃度、功率、超聲時間等因素對得率有較大的影響。

本文以野金柴為原料,采用響應(yīng)面法優(yōu)化野金柴總黃酮的超聲輔助提取工藝,并用ADS-7大孔樹脂分離總黃酮中的根皮苷,進而對比總黃酮、根皮苷、黃酮R(除去根皮苷后的剩余黃酮組分)的抗氧化能力,為野金柴中黃酮類化合物的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),提高野金柴的生產(chǎn)利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野金柴 殼斗科櫟屬植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥葉,江西葉苷清生物科技有限公司提供;蘆丁(生化試劑≥98%)、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、VC和Trolox 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀 分析純,天津大貿(mào)公司;鹽酸、無水乙醇 分析純,西隴科學(xué)公司。

DGG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;AR323CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司;TDL-5-A飛鴿牌臺式離心機、FW80高速萬能粉碎機 上海安亭科學(xué)儀器廠;GA92-IID超聲波粉碎機 無錫市上佳生物技術(shù)有限公司;722G可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ELx800光吸收酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;EZ-L100-P200中壓制備系統(tǒng) 利穗科技(蘇州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野金柴預(yù)處理 將野金柴樣品放入恒溫干燥箱內(nèi)60 ℃烘干至恒重,粉碎,過60目篩,收集粉末,密封,低溫保存。

1.2.2 野金柴總黃酮提取 精確稱取適量野金柴粉末,加一定濃度乙醇溶液混合均勻,靜置10 min,按照設(shè)定好的條件,進行超聲波輔助提取,提取液4200 r/min離心6 min,離心后取上清液待測。

1.2.3 野金柴中總黃酮的測定

1.2.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取12.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中,用75%乙醇定容,即得0.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于10 mL容量瓶中,分別加入5% NaNO2溶液0.4 mL,搖勻靜置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,搖勻靜置6 min,加4% NaOH溶液4 mL,加無水乙醇定容,搖勻靜置10 min,按照分光光度法,在510 nm處測吸光度A[10],以吸光度A為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=13.04435C-0.00287,R2=0.9996。

1.2.3.2 黃酮得率計算 精密吸取野金柴黃酮提取液0.5 mL于10 mL容量瓶中,按上述方法測定樣品中總黃酮含量。按照以下公式計算得率(F):

式中:C為由回歸方程計算出黃酮的濃度,mg/mL;N-稀釋倍數(shù);V-提取液體積,mL;M-稱取的野金柴粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 野金柴總黃酮提取單因素實驗 高溫易改變黃酮類物質(zhì)活性,且不利于調(diào)控,因此固定提取溫度30 ℃,同時其余因素不變,考察乙醇濃度、液料比、功率、超聲時間等單因素對野金柴總黃酮得率的影響,每組實驗重復(fù)三次。

1.2.4.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響 在液料比30∶1、功率500 W、超聲時間30 min的條件下,分別考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液料比對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、功率500 W、超聲時間30 min的條件下,分別考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.3 超聲功率對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、液料比30∶1、超聲時間30 min的條件下,分別考察功率300、400、500、600、700 W對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.4 超聲時間對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、液料比30∶1、功率500 W的條件下,分別考察提取時間20、30、40、50、60 min對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理,基于單因素實驗結(jié)果,以液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、超聲時間(D)為響應(yīng)因素,編碼水平為-1、0、1,野金柴黃酮得率(F)為響應(yīng)值,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計[11],因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)曲面試驗因素水平設(shè)計

1.2.6 大孔樹脂法分離總黃酮中的根皮苷

1.2.6.1 大孔樹脂的預(yù)處理 按李斌等[12]的方法對大孔樹脂進行預(yù)處理。

1.2.6.2 吸附與洗脫 用野金柴總黃酮提取液對預(yù)處理好的大孔樹脂進行浸泡,并采用常規(guī)濕法裝柱,使其自然沉降不留氣泡,并靜態(tài)吸附10 h。采用EZ Purifier中壓制備系統(tǒng)進行自動吸附洗脫,同時配備紫外分光光度檢測器進行自動檢測分離。以3 BV的流速進行上樣動態(tài)吸附0.5 h,共計上樣500 mL。之后使用70%乙醇溶液以2 BV的流速進行洗脫1 h,并設(shè)定在紫外吸收285 nm處收集根皮苷溶液[13];之后再用75%、85%、95%乙醇溶液以2 BV的流速各洗脫0.5 h,將樹脂內(nèi)剩余吸附物質(zhì)全部洗出。70%乙醇洗脫2 BV可將大多數(shù)根皮苷洗下,之后的遞增梯度洗脫可將剩余黃酮物質(zhì)洗脫[14]。洗脫液進入紫外分光光度檢測器中,設(shè)定根皮苷收集波長為285 nm[15],收集閾值300 mAU,自動收集器采用多管收集的方式將洗脫液收集,在285 nm下無吸收的其他組分則流入回收裝置,完成對根皮苷與黃酮R的分離。參考金弘昕等[6]的結(jié)論,野金柴黃酮類物質(zhì)除根皮苷外,還含有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羥基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷,故黃酮R即為上述黃酮物質(zhì)的多組分溶液。

1.2.6.3 濃縮與收集 將純化的根皮苷溶液、總黃酮溶液、黃酮R溶液分別經(jīng)旋蒸濃縮,氮吹后收集。

1.2.7 抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測定 以維生素C(10、15、20、25、30、35、40 mg/mL)作為陽性對照,分別檢測10、15、20、25、30、35、40 mg/mL濃度的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、純化根皮苷溶液對0.2 mmol/L DPPH溶液的自由基清除率。分別測定VC和三種溶液對DPPH自由基的清除率,清除率越高表明清除自由基的能力越強,即抗氧化能力越強。精密吸取100 μL的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、根皮苷溶液,分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光靜置30 min,在517 nm下用酶標(biāo)儀測定其吸光值A(chǔ)樣品,以乙醇為空白,在517 nm下用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)空白[16]。按下式計算自由基清除率,且以清除率為縱坐標(biāo),溶液濃度為橫坐標(biāo)繪圖,維生素C作為陽性對照,實驗重復(fù)三次,取平均值和SD值:

1.2.7.2 清除ABTS自由基活性的測定 分別檢測10、15、20、25、30、35、40 mg/mL濃度的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、純化根皮苷溶液對ABTS溶液的自由基清除率。用去離子水配制7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液。取過硫酸鉀溶液5.00 mL,加入到15.00 mL ABTS溶液中,在室溫下置于黑暗處反應(yīng)16 h,形成ABTS自由基儲備液。用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇對ABTS自由基儲備液進行稀釋,使其在734 nm下的吸光度為0.70±0.05,即為ABTS稀釋液,備用。取200 μL ABTS稀釋液與20 μL樣品振蕩混勻6 min,在734 nm下測定其吸光度A樣品。取200 μL ABTS稀釋液與20 μL溶劑振蕩混勻6 min,在734 nm下測定其吸光度A空白作為空白對照[17]。按公式計算自由基清除率,以清除率為縱坐標(biāo),溶液濃度為橫坐標(biāo)繪圖,為能多角度地反映總黃酮、黃酮R、根皮苷的抗氧化能力,采用Trolox作為陽性對照,實驗重復(fù)三次,取平均值和SD值:

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值,通過運用Excel、OriginPro 9.0數(shù)據(jù)處理軟件和Design-Expert.8.05、SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨乙醇濃度的變化如圖1所示。由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,野金柴總黃酮提取得率呈現(xiàn)出增加的趨勢。當(dāng)乙醇溶液濃度達到80%后,提取得率的提升幅度明顯放緩,基本與乙醇濃度在80%處持平。這可能是由于當(dāng)乙醇濃度較低時,水分子數(shù)量較大,細(xì)胞發(fā)生溶脹導(dǎo)致離子通道受阻[18],黃酮無法順利從細(xì)胞被分離,而當(dāng)乙醇濃度達到80%時,黃酮極性與提取液的極性相似,得率最大。因此,選擇70%～90%的乙醇濃度作為野金柴總黃酮的最佳提取濃度范圍。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.1.2 液料比對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨液料比的變化如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)液料比從10∶1增加到30∶1時,野金柴總黃酮的提取得率呈現(xiàn)出較為明顯的增長速度,其原因可能是隨著液料比的增長,野金柴細(xì)胞溶脹性提高,野金柴細(xì)胞與溶劑的接觸面積增大[19]。當(dāng)液料比由30∶1增長到40∶1時,增加趨勢基本消失,液料比從40∶1增加到50∶1時,總黃酮提取得率出現(xiàn)下降,這可能是因為溶劑量過多時,一些其他化合物也被提取出來,使得率呈下降趨勢[20]。雖然總黃酮提取得率在液料比40∶1時最大,但由于液料比從30∶1增加到40∶1,需要消耗更多的溶劑,且提取得率的增幅并不明顯。綜合考慮,選擇30∶1～50∶1的液料比范圍作為野金柴總黃酮提取的最佳液料比范圍。

圖2 液料比對總黃酮得率的影響

2.1.3 超聲功率對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨超聲功率的變化如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)功率由300 W遞增到500 W時,總黃酮得率呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢,但當(dāng)功率由500 W增加到700 W時,總黃酮得率下降。這可能是由于當(dāng)超聲功率在300～500 W范圍內(nèi)時,空化泡的形成隨功率的升高而變得更容易,并且空化泡的崩解也隨功率的升高而變得更加劇烈;當(dāng)功率超過500 W后,空化泡增長得過大,以至于不能崩解或者很脆弱的崩解,大大降低了空化作用的效果,并且過多的空化泡也會阻礙超聲波的傳播[21]。且隨著功率的增加,溶液溫度可能升高,從而導(dǎo)致黃酮活性發(fā)生改變。因此,當(dāng)其他條件相同時,選擇400～600 W的功率范圍作為最佳提取功率范圍。

表2 Box-Benhnken實驗設(shè)計和結(jié)果

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響

2.1.4 超聲時間對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨超聲時間的變化如圖4所示。由圖4可知,隨著超聲時間的增加,野金柴總黃酮提取得率呈現(xiàn)出增長的趨勢,當(dāng)超聲時間到達50 min后,提取得率提升不明顯,與超聲時間為50 min時差別不大?？赡苁窃诔晻r間增大的過程中,超聲波空化泡作用與空化泡崩解產(chǎn)生的機械作用有利于乙醇溶液進入組織內(nèi),加快了黃酮的溶出[22],當(dāng)時間達到50 min后,組織內(nèi)大部分黃酮被提取完全,剩余部分極少,增大超聲時間也難以提升黃酮得率。且若再增大超聲時間,探頭的溫度會隨之增加,導(dǎo)致提取劑的蒸發(fā)流失[23-24],可能導(dǎo)致黃酮得率反而下降。因此,在確定其他條件一致時,可選擇超聲時間40～60 min作為野金柴總黃酮的最佳超聲時間范圍。

圖4 超聲時間對總黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面方案設(shè)計 選取(A)液料比、(B)乙醇濃度、(C)超聲功率、(D)超聲時間四個因素,設(shè)計三個水平實驗,野金柴黃酮得率為響應(yīng)值。實驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。

2.2.2 方差分析及顯著性檢測 用軟件Design-Expert.8.05對以上數(shù)據(jù)進行回歸分析,結(jié)果如表3所示。對各因素回歸擬合,可得如下野金柴黃酮得率F(%)的回歸方程:

F=+8.81+0.011A+0.11B+0.077C+0.24D-0.078A2-0.089B2-0.23C2-0.23D2+0.013AB+0.038AC+0.018AD+0.0025BC-0.01BD+0.013CD

圖5 液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、超聲時間(D)對總黃酮得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

2.2.3 最優(yōu)工藝條件的確定及模型驗證 通過Design-Expert軟件對回歸方程進行計算,得到超聲波輔助提取野金柴黃酮最佳工藝條件,在液料比41.93∶1,乙醇濃度82.55%,超聲功率539.46 W,超聲時間56.49 min的條件下,得到最高的黃酮得率為8.90%?？紤]到實際條件的可操作性,將最佳工藝條件調(diào)整為:液料比40∶1,乙醇濃度80%,超聲功率540 W,超聲時間60 min。為驗證結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)進行3次重復(fù)實驗,得到野金柴黃酮的實際得率為8.82%±0.09%。同時,有文獻報道,自然存放1個月的多穗柯粗粉總黃酮含量為8.34%,且隨著存放時間延長,總黃酮含量不斷降低,自然存放3個月后,總黃酮含量降為7.46%[25]。實驗所使用的材料野金柴是多穗柯干制葉,參考該結(jié)論,與新鮮多穗柯嫩葉相比,存放時間更長的野金柴總黃酮含量更低,本研究優(yōu)化工藝后,所得的野金柴總黃酮得率較高,說明所得回歸方程對野金柴黃酮得率進行分析和預(yù)測非常可靠,具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

2.3 野金柴黃酮抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 圖6顯示了不同濃度總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH自由基的清除率。在一定范圍內(nèi),野金柴總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH自由基的清除能力都隨濃度的增加而遞增,當(dāng)濃度增加至0.035～0.040 mg/mL時增加趨勢放緩。且三者與VC對DPPH自由基的清除能力排序是VC>總黃酮>根皮苷>黃酮R,VC、總黃酮、根皮苷、黃酮R的IC50值分別為0.0190、0.0205、0.0222、0.0261 mg/mL。雖然黃酮R對DPPH自由基的清除能力比總黃酮和根皮苷要稍弱,但從數(shù)值上來看,黃酮R依舊有較強的DPPH自由基清除能力。

圖6 不同濃度總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH及ABTS自由基清除率

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定 圖6顯示了Trolox、總黃酮、根皮苷、黃酮R對ABTS自由基的清除效果。一定濃度范圍內(nèi),Trolox和總黃酮、根皮苷、黃酮R的ABTS自由基清除能力隨濃度的增加而增大,呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系,Trolox、總黃酮、根皮苷、黃酮R的IC50值分別為0.0201、0.0220、0.0233、0.0266 mg/mL。在相同濃度下,Trolox的自由基清除能力最強,黃酮R最弱,原因可能是野金柴總黃酮中的主要成分是根皮苷,黃酮R中含有槲皮苷等具有抗氧化能力的黃酮,但含量相對較少,因此抗氧化能力較低,但仍有較好的ABTS自由基清除能力。

3 結(jié)論

本實驗使用超聲波輔助提取野金柴總黃酮,并對提取工藝進行優(yōu)化。通過響應(yīng)面法構(gòu)建了超聲波輔助提取野金柴總黃酮的數(shù)學(xué)模型,獲得了最佳提取工藝。采用ADS-7型大孔樹脂對野金柴黃酮中的根皮苷進行初步分離,并對總黃酮、根皮苷和黃酮R的抗氧化活性進行對比研究。結(jié)果表明:各提取條件對野金柴總黃酮得率的影響大小關(guān)系為:超聲時間>乙醇濃度>超聲功率>液料比。優(yōu)化所得最佳提取工藝條件為液料比40∶1,乙醇濃度80%,超聲功率540 W,超聲時間60 min,此條件下野金柴總黃酮得率為8.82%±0.09%。通過大孔樹脂分離所得根皮苷,黃酮R對DPPH自由基和ABTS自由基也有較好的清除效果,是天然的抗氧化資源。目前關(guān)于野金柴黃酮的研究大都局限于總黃酮與根皮苷,尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于野金柴中黃酮R的研究,且對于野金柴的實際工業(yè)應(yīng)用多為提取根皮苷,忽略了對黃酮R進行進一步的生產(chǎn)利用。本實驗通過研究野金柴總黃酮、根皮苷與黃酮R的抗氧化能力,證明黃酮R具有優(yōu)良的抗氧化效果,說明提取完根皮苷的野金柴殘渣也可以加以利用,在實際生產(chǎn)中有其較高的利用價值。