藻藍蛋白-殼聚糖復(fù)合膜的制備及性能表征

羅愛國,趙 琪,2,馬建華,楊艷君,胡變芳,*

(1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山西榆次 030619;2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

隨著消費者對塑料包裝材料安全、環(huán)保問題的擔憂,食品包裝材料的研發(fā)越來越趨向于可降解活性材料。研究者從動物、植物及微生物中提取分離得到多糖、蛋白及脂類等物質(zhì)作為可降解包裝材料[1-3]。殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,由β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖組成天然陽離子多糖,具有良好的成膜性、生物降解性、機械性能、選擇滲透性以及一定的抑菌活性[4-5],在食品可降解活性包裝材料領(lǐng)域、保障食品質(zhì)量安全方面具有廣闊應(yīng)用前景。很多研究將各種天然抗菌等活性物質(zhì)添加到膜中制成活性包裝膜,以改善包裝膜的抑菌性、抗氧化性及包裝性能[6-9]。

鈍頂螺旋藻(ArthrospiraplatensisGomont)為多細胞絲狀藍藻,易培養(yǎng),產(chǎn)量大,是國內(nèi)最早三大產(chǎn)業(yè)化藻類之一,富含藻藍蛋白、多糖、黃酮、酚類、β-胡蘿卜素和γ-亞麻酸等活性物質(zhì)[10]。藻藍蛋白的含量占蛋白總量的40%,主要由藻藍膽素和脫輔基蛋白共價結(jié)合而成,是一種天然抑菌活性成分,且易溶于水、無毒。此外,藻藍蛋白還具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等生理活性[11-13]。藻藍蛋白能夠抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鏈球菌等生長繁殖[14-16],其抑菌譜廣、抑菌作用強。

藻藍蛋白可作為活性抗菌蛋白添加包裝材料。目前有關(guān)藻類活性成分改善包裝膜性能的研究很少。García-Soto等[17]將添加海藻螺旋藻添加到聚乳酸制成環(huán)保型包裝膜,用于魚類保鮮;史建如等[18]將褐藻多酚、殼聚糖及羧甲基纖維素鈉制備成相容性較好、表面致密的可食膜。然而,殼聚糖膜中添加藻類蛋白是否有利于改善膜的形態(tài)與結(jié)構(gòu),值得人們研究。此外,復(fù)合膜的透光性能也是需要探索的問題之一。前期課題組利用藻類活性提取物與殼聚糖復(fù)合成膜,制備抗氧化性更強的復(fù)合可降解膜[19],同時研究了藻藍蛋白-殼聚糖復(fù)合膜制備工藝,初步確定了復(fù)合膜比例為殼聚糖2.0%(w/v)、甘油1.0%(w/v)、乙酸為1%(w/v)。本研究將進一步考察藻藍蛋白添加比例對藻藍蛋白-殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)特性、光線阻隔性、水蒸氣阻隔性、機械性能及抑菌性能的影響,探討其作為食品活性包裝膜的潛能。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

鈍頂螺旋藻粉(食用級) 購于浙江一諾生物科技有限公司;殼聚糖(分子量165 kDa,低粘度,脫乙酰度95%) 西安大豐收生物科技有限公司;其他試劑均為分析純;大腸桿菌ATCC 25922 中國普通微生物菌種保藏管理中心。

EV-2600可見分光光度計 深圳市鴻永精儀科技有限公司;美國Nicolet 670傅立葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;蔡司MERLIN Compact掃描電子顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份公司;CMT4204微機控制電子萬能拉力機 上海恒企精密機械廠;PERMETM W3/030水蒸氣透過率測試儀 濟南蘭光機電技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻藍蛋白的提取及含量測定 藻藍蛋白的提取參照李冰等[20]的方法,并做了部分修改。取鈍頂螺旋藻粉,按料液比1∶20 (g/mL)加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.0),經(jīng)高速攪拌0.5 h后,先后在-18和38 ℃溫度條件下靜置24 h,并反復(fù)凍融三次。在7000 r/min下冷凍(4 ℃)離心0.5 h,取上清液,加入硫酸銨(飽和度50%)鹽析24 h沉淀蛋白。得到蛋白沉淀再次用適量的PBS溶解,置于截留分子量為12 kDa的透析袋,在PBS中透析24 h除去銨離子,得藻藍蛋白(AP)。AP含量的測定采用考馬斯亮藍法,以標準牛血清白蛋白建立標準曲線,得回歸方程y=0.7504 x+0.0234,R2=0.9954,測得其含量為59.72%±2.60%。

1.2.2 藻藍蛋白/殼聚糖可降解活性膜的制備 藻藍蛋白/殼聚糖復(fù)合膜制備參照Siripatrawan等[21]的方法,并作部分修改。用100 mL 1%的乙酸溶液溶解2 g殼聚糖,并加入1 g甘油,在60 ℃水浴中磁力攪拌30 min(100 r/min),制得殼聚糖膜溶液。將AP溶于殼聚糖膜溶液中配制成濃度為0、0.5%、0.75%和1.0%(w/v)的復(fù)合膜溶液,經(jīng)均質(zhì)、真空脫氣后,在自制成膜器(30 cm×15 cm)上流延成膜,經(jīng)室溫干燥24 h后揭膜,制得單一殼聚糖膜(CH-film)和藻藍蛋白/殼聚糖復(fù)合膜(AP/CH-film),于25 ℃、相對濕度50%的干燥器中貯存?zhèn)錅y。

1.2.3 紅外光譜掃描 采用傅立葉紅外光譜儀進行分析,以透射模式進行掃描,掃描范圍為4000～500 cm-1,掃描次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1。

1.2.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察 將膜樣品裁成5 mm×5 mm方塊,用導(dǎo)電膠固定在銅臺上,真空噴金后,用掃描電子顯微鏡在5 kV加速電壓下,對膜樣品的表面和橫截面結(jié)構(gòu)進行掃描觀察,平面和截面的放大倍數(shù)分別為1000和5000。

1.2.5 不透明度的測定 膜不透明度的測定參照Park等[22]的方法,取樣品膜在UV計600 nm波長處測定OD值,未放置樣品時作為空白對照,每個樣品重復(fù)測定5次,樣品的不透明度用公式(1)計算:

式(1)

式中:A600為膜在波長為600 nm處的OD值;d為膜厚度,mm。

1.2.6 水蒸氣透過性的測定 參照GB/T 037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法杯式法》[23],選擇厚度均勻的膜樣品,用石蠟密封于裝有無水氯化鈣的透濕杯口,并將透濕杯置于溫度為25 ℃、相對濕度為75%的干燥器(內(nèi)裝飽和氯化鈉溶液)中,每隔24 h稱透濕杯的質(zhì)量。每個樣品重復(fù)測定5次。計算公式見式(2)。

式(2)

式中:Δm為t時間內(nèi)的質(zhì)量增量,g;d為試樣厚度,m;A為試樣透水蒸氣的面積,m2;Δp為試樣兩側(cè)的水蒸氣壓差,Pa;t為質(zhì)量穩(wěn)定后的兩次間隔時間,s。

1.2.7 拉伸性能的測定 采用GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的測定》[24]方法,用微機控制電子萬能拉力機測定膜的抗拉強度和斷裂伸長率。將膜裁成150 mm×15 mm的矩形,測定前在25 ℃、相對濕度為50%條件下平衡2 d,用螺旋測微器測膜的中心及四角的厚度(取平均值),設(shè)定原始標距為100 mm,拉伸速率為50 mm/min,記錄膜斷裂時的最大長度與最大拉力。膜樣品測定重復(fù)5次。計算公式見式(3)和式(4):

式(3)

式(4)

式中:Fmax為膜樣品斷裂時的最大拉力,N;l為膜樣品寬度,mm;d為膜樣品厚度,mm;l1為膜樣品斷裂時的最大長度,mm;l0為膜樣品的初始長度,mm。

1.2.8 抑菌活性測定 參照陳桂蕓等[25]的方法,并稍做修改。以大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)為試驗菌種,用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)活化,經(jīng)10倍稀釋法配制成菌落數(shù)為1×106CFU/mL的菌懸液。將50 ℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,冷卻20 min到凝固,加入0.1 mL菌懸液,涂布均勻制成帶菌平板,將裁成直徑為0.6 cm的膜樣品貼于平板中央,倒置于培養(yǎng)箱中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑(十字交叉法)。實驗重復(fù)測定5次,以殼聚糖膜為空白對照。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

殼聚糖復(fù)合膜(AP/CH-film)紅外光譜見圖1,所有樣品的紅外光譜圖顯示相似的圖譜形狀,為殼聚糖膜的典型紅外光譜特征。單一殼聚糖膜(CH-film)在3240 cm-1具有強吸收,主要由是-NH和-OH的伸縮振動引起;在2930 cm-1處是-CH2-基團吸收峰,2880 cm-1吸收峰是-CH3的特征吸收;1630、1550及1340 cm-1為酰胺吸收峰,在1630 cm-1為C=O伸縮振動峰(酰胺Ⅰ帶)、1550 cm-1為N-H伸彎曲振動峰(酰胺Ⅱ帶)及1340 cm-1為C-N伸縮振動產(chǎn)生(酰胺Ⅲ帶);1411 cm-1吸收峰與羧酸酯基團有關(guān),而1020 cm-1的吸收峰是C-O-C鍵的對稱伸縮振動形成,這些典型的殼聚糖膜紅外光譜特征與之前的文獻報道一致[10,21,26],且在復(fù)合膜(AP/CH-film)光譜中均能被觀察到。添加藻藍蛋白復(fù)合膜光譜特征除在3240 cm-1的吸收峰向高波方向有輕微漂移外,其它位置的吸收峰強度與位置基本不變。復(fù)合膜具有相同的光譜特征和漂移情況可以推斷,盡管在成膜過程中藻藍蛋白與殼聚糖分沒有共價鍵和化學(xué)作用的變化發(fā)生,但能形成分子間氫鍵[27]。與單一殼聚糖膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜沒有新峰出現(xiàn),表明AP與殼聚糖相容。

圖1 AP/CH-film的紅外光譜圖

2.2 微觀結(jié)構(gòu)掃描觀察

膜的形態(tài)在一定程度上決定了其理化性質(zhì),AP/CH-film電鏡掃描結(jié)果如圖2所示。在1000放大倍數(shù)下,單一殼聚糖膜表面有明顯紋理,AP/CH-film復(fù)合膜相對較為光滑平整,且這種表面形態(tài)隨藻藍蛋白比例的添加更為明顯。SEM分析表明,膜表面、斷面是均勻的,沒有裂紋以及氣孔,藻藍蛋白與殼聚糖膜復(fù)合具有很好的相容性。與陳桂蕓等制備的植物蛋白復(fù)合膜(玉米蛋白/殼聚糖)復(fù)合膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜內(nèi)外部沒有明顯裂紋、氣孔[25];與Zhang等制備的菜籽蛋白-殼聚糖復(fù)合膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜表面平整、無皺紋[28]。

圖2 AP/CH-film的掃描電鏡表面和截面圖

2.3 AP/CH-film的不透明度

不透明度是影響包裝膜材料總體外觀和消費者接受性的重要指標。AP/CH-film的不透明度結(jié)果見表1,復(fù)合膜的不透明度隨AP添加量的增加而顯著增大(P<0.05)。CH-film的不透明度為1.124 Abs600·mm-1,當添加量為1.0%時,AP/CH-film的不透明度為3.927 Abs600·mm-1,增加了2.4倍。由于AP是捕光色素蛋白,與殼聚糖分子復(fù)合時,在一定程度上增加了復(fù)合膜對可見光的吸收,增大了不透明度。此外,藻藍蛋白分子與殼聚糖大分子能夠形成致密結(jié)構(gòu)(見SEM結(jié)果),影響到光線透射率,同時也會增大復(fù)合膜的不透明度。AP/CH-film復(fù)合膜這種降低光線的透射性,在一定程度上會影響到肉裝物的可視性,而對光敏食品具有一定阻光性。

表1 AP/CH-film的物理性質(zhì)及機械性能

2.4 AP/CH-film的水蒸氣透過性

包裝材料的良好阻隔性是保證產(chǎn)品質(zhì)量的主要性能之一,水蒸氣透過性決定水蒸氣在內(nèi)外部環(huán)境中相互滲透程度,影響著產(chǎn)品質(zhì)量。表1為AP/CH-film的水蒸氣透過系數(shù),當AP添加量為0.75%,AP/CH-film的水蒸氣透過系數(shù)顯著降低(P<0.05),AP的添加在一定程度增強了復(fù)合膜的水蒸氣阻隔性能。復(fù)合膜水蒸氣透過系數(shù)與其自身結(jié)構(gòu)有關(guān)[29],AP的摻入可與殼聚糖膜分子形成更均一結(jié)構(gòu),改變了膜結(jié)構(gòu),降低水蒸氣分子在膜鏈中遷移率,在一定程度上阻礙了水蒸氣滲透性。

2.5 AP/CH-film的機械性能

膜的機械性能對于保證食品在運輸與貯藏過程中的免受外力損傷等方面起著非常重要的作用[30]。如表1所示,復(fù)合膜AP/CH-film的抗拉強度隨著AP的添加量增加而顯著降低(P<0.05)。單一CH-film的抗拉強度為16.22 MPa,當添加0.75%AP時,AP/CH-film的抗拉強度顯著減小到13.73 MPa(P<0.05);AP/CH-film斷裂伸長率隨AP含量增加而增大,1.0% AP/CH-film的斷裂伸長率為79.73%。類似研究報道,以明膠蛋白與殼聚糖制膜,在優(yōu)化配比6∶4條件下復(fù)合膜斷裂伸長率可增加到30.46%[31];此外,陳桂蕓等[25]發(fā)現(xiàn)玉米醇蛋白復(fù)合膜在殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為8%時,斷裂伸長率可提高到6.67%。蛋白可增加殼聚糖復(fù)合膜的斷裂伸長率,藻藍蛋白的這種增強作用尤其明顯。膜的機械性能主要與膜基質(zhì)中的聚合物主鏈之間分子內(nèi)和分子外相互作用的分布及密度有關(guān)[32]。藻藍蛋白為水溶性高分子化合物,當與殼聚糖溶液混合成膜時,AP與殼聚糖分子間形成的作用力,使殼聚糖膜分子結(jié)構(gòu)排布受到影響,改變了殼聚糖膜分子鏈的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),致使變形抗力減小,抗拉強度降低;藻藍蛋白分子與殼聚糖分子鏈能夠充分纏結(jié),交聯(lián)形成更均勻的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)對膜機械性能有積極作用[25],能夠改善膜材料的柔韌性,提高復(fù)合膜的斷裂伸長率。

2.6 AP/CH-film的抑菌性

圖3 AP/CH-film的抑菌活性

3 結(jié)論

相比殼聚糖膜,適當添加藻藍蛋白使得AP/CH-film復(fù)合膜在阻光性、阻濕性、延展性、抑菌性方面有所增強。1.0% AP/CH-film表面更均一光滑,具有較高的不透明性，可有效阻隔光線引起內(nèi)裝物成分的改變,且較低的水蒸氣透過率可延長內(nèi)裝物水分含量穩(wěn)定期;與復(fù)合其他蛋白物質(zhì)相比,復(fù)合藻藍蛋白可提高AP/CH-film的延展性,且具備較強的抗菌特性,這一特點在制備可纏繞食品保鮮包裝材料、藥物緩釋材料等方面具有很大潛力。鑒于本研究抑菌試驗菌種只有細胞大腸桿菌,復(fù)合膜在其它致病菌抑菌性能有待于進一步研究,且AP/CH-film復(fù)合膜抑菌機理及在食品保鮮中的應(yīng)用也需要深入研究。