根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)荸薺稈枯病菌轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建及突變體篩選

黃偉華，吳碧球，顏梅新

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】荸薺屬莎草科多年生草本植物，廣泛栽培于我國(guó)和印度，美國(guó)、澳大利亞和日本等國(guó)亦有種植[1-2]。荸薺球莖含有豐富的碳水化合物，可作為水果和蔬菜食用，亦可作藥物用于治療便秘、喉炎和咽炎等[3]。然而稈枯病菌(Cylindrosporiumeleocharidis)引起的荸薺稈枯病(俗稱荸薺瘟)發(fā)生普遍，引起荸薺產(chǎn)量和品質(zhì)降低，影響荸薺產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]，但迄今對(duì)該菌分子水平的研究涉及較少，對(duì)其致病機(jī)理了解甚少，影響了防治水平的提高。因此，建立荸薺稈枯病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系及構(gòu)建覆蓋全基因組的突變體庫(kù)，對(duì)荸薺稈枯病菌的分子機(jī)理研究及其防治工作開(kāi)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】1962年美國(guó)首次報(bào)道荸薺稈枯病，其病原菌為C.eleocharidis[4]，我國(guó)江蘇省于1985年首次報(bào)道荸薺稈枯病的發(fā)生[6]，隨后廣西報(bào)道了荸薺稈枯病的發(fā)生與危害，并建立了荸薺稈枯病的發(fā)生和流行與氣溫、濕度、降量、露水等環(huán)境因素密切相關(guān)的預(yù)測(cè)模型[7]，湖北省報(bào)道了荸薺稈枯病的發(fā)生并對(duì)該病菌進(jìn)行生物學(xué)研究[8]。目前，絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為植物病原真菌分子遺傳和基因功能研究的重要手段，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)已成功應(yīng)用于Fusariumoxysporum、Aspergillusjaponicus、Pseudocercosporafijiensis和Sporisoriumscitamineum等絲狀真菌[9-12]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化方法相比其他幾種真菌轉(zhuǎn)化方法(PEG-MT、REMI和基因槍等)具有轉(zhuǎn)化受體可為多種類型、轉(zhuǎn)化效率較高、隨機(jī)單拷貝插入多及轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[13]。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)荸薺稈枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及該菌突變體庫(kù)構(gòu)建的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)建立高效的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建該菌突變體庫(kù)，并對(duì)突變體進(jìn)行表型及致病性篩選，為分子水平上研究荸薺稈枯病菌的基因功能及致病機(jī)理提供技術(shù)支持和研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株(荸薺稈枯病病原菌菌株Ceh)與雙元載體pEX4(含綠色熒光蛋白GFP)均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 潮霉素B對(duì)菌株Ceh的抑制作用 將Ceh在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，利用打孔器從菌落邊緣打孔，挑取直徑8 mm菌塊分別接種于含不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，7 d后觀察菌落的生長(zhǎng)情況并測(cè)量菌落直徑。潮霉素B設(shè)0、10、20、50、100和150 μg/mL 6個(gè)濃度處理，每處理重復(fù)3次。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)菌株Ceh遺傳轉(zhuǎn)化 參照Sun等[11]的方法，并作適當(dāng)修改。挑取含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落，接種于加入壯觀霉素(50 μg/mL)和利福平(50 μg/mL)的MM液體培養(yǎng)液中，在200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)48 h，用IM液體培養(yǎng)液稀釋OD600至約0.15，分別加入或不加AS，在200 r/min、28 ℃下預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，測(cè)得OD600約為0.50時(shí)即可用于共培養(yǎng)。分別取上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)液和荸薺稈枯病菌孢子懸浮液各100 μl混合液涂在加入AS并覆蓋了纖維素濾膜的IM固體培養(yǎng)基上，28 ℃下共培養(yǎng)24～72 h。轉(zhuǎn)移纖維素濾膜至含有潮霉素B和頭孢噻肟鈉PDA的平板上，28 ℃下培養(yǎng)8～10 d，以獲得轉(zhuǎn)化子。將長(zhǎng)出的單菌落用牙簽挑到含有潮霉素B的PDA上進(jìn)行二次篩選。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率影響因素優(yōu)化 設(shè)不同病菌孢子濃度(105、106、107、108和109個(gè)/mL)、IM培養(yǎng)基pH(2.5、5、5.3、5.6、6.0、6.5和7.0)、農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時(shí)間(0、2、4、6、8和10 h)、共培養(yǎng)介質(zhì)(硝酸纖維素膜、玻璃紙、定性濾紙和Hybond-N膜)、誘導(dǎo)共培養(yǎng)時(shí)AS濃度(0、100、200、300和400 μmol/L)及共培養(yǎng)時(shí)間(48、72和96 h)等處理，進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以上處理均設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

1.2.4 病原菌轉(zhuǎn)化子分子檢測(cè) 隨機(jī)選取荸薺稈枯病病原菌轉(zhuǎn)化子，采用真菌DNA提取試劑盒(OMEGA，D3690-01)提取突變體DNA。通過(guò)引物hph1 5′-GCCGATGGCTTCTACAAGGATAG-3′和hph2 5′-CTCACGATGGCATCGCACCT-3′對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)，其PCR反應(yīng)程序和Southern blotting轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證參考Yan等的方法[14]。

1.2.5 病原菌轉(zhuǎn)化子熒光檢測(cè) 用接種環(huán)刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的病原菌Ceh，加入無(wú)菌水制成玻片，在熒光顯微鏡(Carl Zeiss，德國(guó))下檢測(cè)熒光。

1.2.6 病原菌突變體菌落形態(tài)分析 將野生型菌株和轉(zhuǎn)化子置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，利用打孔器分別從菌落邊緣打孔，挑取直徑5 mm的菌餅接種至新PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)7 d，分析菌落形態(tài)。

1.2.7 病原菌突變體致病性測(cè)試 選取15 cm長(zhǎng)并經(jīng)75 %酒精消毒的荸薺新鮮莖稈，采用離體刺傷法，按照1.2.6中的方法挑取直徑5 mm的菌餅接種至莖稈傷口處，置于搪瓷盆中加濕水濾紙保濕，室溫放置，7 d后觀察莖稈發(fā)病情況，測(cè)量病斑面積。病原菌野生型和突變體接種處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

圖1 荸薺稈枯病病原菌對(duì)潮霉素B敏感性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Sensitivity of C. eleocharidis to hygromycin B

2 結(jié)果與分析

2.1 荸薺稈枯病病原菌菌株Ceh對(duì)潮霉素B的敏感性測(cè)定結(jié)果

從圖1可看出，病菌菌株Ceh在不含潮霉素B的PDA平板上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑平均為55 mm，而在含10 μg/mL以上潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，說(shuō)明病原菌菌株Ceh對(duì)潮霉素B較敏感。為確保農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化效率，本研究確定100 μg/mL為潮霉素最佳濃度。

2.2 不同因素對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響

2.2.1 農(nóng)桿菌與病原菌菌株Ceh共培養(yǎng)時(shí)間的影響 從圖2可看出，農(nóng)桿菌與病原菌菌株Ceh共培養(yǎng)48 h時(shí)平均每個(gè)培養(yǎng)皿(9 cm)獲得20.0個(gè)轉(zhuǎn)化子，共培養(yǎng)72 h時(shí)獲得49.7個(gè)轉(zhuǎn)化子/皿，而當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至96 h時(shí)，可獲得70.3個(gè)轉(zhuǎn)化子/皿。方差分析結(jié)果表明，不同共培養(yǎng)時(shí)間處理間的轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異(P<0.05，下同)。說(shuō)明共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)病原菌菌株Ceh的轉(zhuǎn)化效率越高。

圖柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)，the same as below圖2 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effects of co-cultivation time for A.tumefaciens on transformation

2.2.2 IM固體培養(yǎng)中AS濃度的影響 農(nóng)桿菌與病原菌菌株Ceh孢子等量混勻后在IM固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)AS濃度為0時(shí)，平板上抗性菌落數(shù)為0；當(dāng)AS濃度為200 μmol/mL時(shí)，獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)為31.7個(gè)/皿；當(dāng)AS濃度為300 μmol/mL時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率達(dá)最高值，獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)為56.3個(gè)/皿，當(dāng)AS濃度為400 μmol/mL時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)反而減少(52.0個(gè)/皿)，但轉(zhuǎn)化效率仍較高。方差分析結(jié)果表明，不同IM固體培養(yǎng)基中AS濃度處理間轉(zhuǎn)化效率的差異顯著。說(shuō)明隨著共培養(yǎng)基中AS濃度的提高，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)提高，本研究以IM固體培養(yǎng)中AS濃度300 μmol/mL為最佳濃度。

圖3 IM固體培養(yǎng)基中AS濃度對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of acetosyringone(AS) concentration in IM cultivation medium on transformation efficiency

圖4 農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effects of induce time for A.tumefaciens on transformation efficiency

2.2.3 農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時(shí)間的影響 從圖4可看出，當(dāng)農(nóng)桿菌誘導(dǎo)生長(zhǎng)6 h時(shí)病原菌菌株Ceh的轉(zhuǎn)化效率最高，獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)為31.6個(gè)/皿；其次是誘導(dǎo)8 h，可獲得轉(zhuǎn)化子12.0個(gè)/皿；最差的是誘導(dǎo)0 h，但仍可獲得轉(zhuǎn)化子1.3個(gè)/皿。方差分析結(jié)果表明，農(nóng)桿菌誘導(dǎo)6 h處理的轉(zhuǎn)化效率與其他誘導(dǎo)時(shí)間處理間的轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異，誘導(dǎo)10 h處理與誘導(dǎo)2 h和4 h處理間的轉(zhuǎn)化效率差異不顯著(P>0.05，下同)。說(shuō)明農(nóng)桿菌誘導(dǎo)生長(zhǎng)時(shí)間不同對(duì)病原菌菌株Ceh的轉(zhuǎn)化效率存在差異，其中誘導(dǎo)時(shí)間為6 h對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率最高。

2.2.4 病原菌菌株Ceh孢子濃度的影響 從圖5可看出，農(nóng)桿菌在誘導(dǎo)6 h時(shí)分別對(duì)105～109個(gè)/mL共5個(gè)濃度梯度的病原菌菌株Ceh孢子液進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其中孢子濃度為107個(gè)/mL的孢子液轉(zhuǎn)化效率最高，可獲得轉(zhuǎn)化子77.7個(gè)/皿，低于或高于該濃度處理的轉(zhuǎn)化率均降低。方差分析結(jié)果表明， 105～109個(gè)/mL 5個(gè)孢子濃度處理間的轉(zhuǎn)化效率均存在顯著差異。說(shuō)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)荸薺稈枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化的最佳孢子濃度為107個(gè)/mL。

圖5 荸薺稈枯病病原菌孢子濃度對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effects of the concentration of C. eleocharidis spore on transformation efficiency

圖6 共培養(yǎng)基pH對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effects of pH in co-cultivation medium on transformation efficiency

2.2.5 共培養(yǎng)基pH的影響 從圖6可看出，在農(nóng)桿菌誘導(dǎo)6 h、病原菌菌株Ceh孢子濃度為107個(gè)/mL條件下，當(dāng)共培養(yǎng)基pH為5.6時(shí)可獲得轉(zhuǎn)化子72.7個(gè)/皿，而pH 在6.5和7.0時(shí)未獲得轉(zhuǎn)化子，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率為0，不適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；在余下所測(cè)試pH下農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率極低，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)未超過(guò)12.0個(gè)/皿。方差分析結(jié)果表明，共培養(yǎng)基pH 5.6處理的轉(zhuǎn)化效率與其他pH處理間的轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異，共培養(yǎng)基pH 4.5、5.0、6.5和7.0處理間的轉(zhuǎn)化效率差異不顯著?？梢?jiàn)，在農(nóng)桿菌誘導(dǎo)6 h、病菌Ceh孢子濃度為107個(gè)/mL條件下共培養(yǎng)基pH為5.6最適宜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

2.2.6 不同共培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響 分別使用玻璃紙、濾紙、Hybond-N膜、硝化纖維膜等4種共培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示使用硝化纖維膜時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，可獲得轉(zhuǎn)化子35.0個(gè)/皿，其次是使用Hybond-N膜，獲轉(zhuǎn)化子11.0個(gè)/皿，使用玻璃紙和濾紙的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率最低，僅分別獲得轉(zhuǎn)化子3.0和4.6個(gè)/皿(圖7)。方差分析結(jié)果表明，硝化纖維膜處理的轉(zhuǎn)化效率與其他處理的轉(zhuǎn)化效率均存在顯著差異，Hybond-N膜處理與濾紙和玻璃紙?zhí)幚淼霓D(zhuǎn)化效率差異顯著，而濾紙和玻璃紙?zhí)幚黹g的轉(zhuǎn)化效率差異不顯著。說(shuō)明不同濾膜對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響存在差異，其中硝化纖維膜作為共培養(yǎng)介質(zhì)時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率最高。

圖7 不同共培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.7 Effects of co-cultivation substrate for A.tumefaciens on transformation efficiency

M：DNA Marker DL2000；1～13：隨機(jī)挑選的荸薺稈枯病菌轉(zhuǎn)化子；14：WT17即原始菌株；15：陰性對(duì)照；16：陽(yáng)性對(duì)照 M：DNA marker DL2000；Lane 1-13：Randomly selectedtransformants of C. eleocharidis，Lane 14：WT17, wild type of C. eleocharidis;Lane 15：Negative control;Lane 16：Positive control圖8 荸薺稈枯病病原菌轉(zhuǎn)化子hph基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.8 PCR detection for the presence of hph gene from randomly selected transformants of C. eleocharidis

2.3 病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證

以雙元載體pEx4上的潮霉素基因(hph)為模板設(shè)計(jì)引物hph1和hph2對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖8)顯示轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出目的條帶750 bp，說(shuō)明T-DNA已插入荸薺稈枯病病原菌中。

2.4 病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子的Southern blotting雜交驗(yàn)證

對(duì)隨機(jī)挑選的病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子及對(duì)照病原菌菌株Ceh的基因組DNA用于酶切、電泳和轉(zhuǎn)膜，以hph基因片段為探針進(jìn)行雜交，以檢測(cè)外源T-DNA插入的拷貝數(shù)，結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)除對(duì)照無(wú)帶外，9個(gè)轉(zhuǎn)化子的Southern blotting雜交結(jié)果均為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)外源T-DNA片段已成功轉(zhuǎn)入荸薺稈枯病菌的基因組DNA中。從圖9可看出，在插入的外源T-DNA突變體中，7個(gè)突變體為單拷貝，其余2個(gè)為雙拷貝，說(shuō)明本研究中外源T-DNA插入的單拷貝率達(dá)77.8 %。

2.5 病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

在所獲得的病原菌Ceh轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選取10.0個(gè)，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代，再轉(zhuǎn)到含有潮霉素(100 μg/mL)的PDA平板上，轉(zhuǎn)化子仍能繼續(xù)生長(zhǎng)，說(shuō)明插入的外源T-DNA已整合到荸薺稈枯病菌的基因組中，且能隨著病原菌菌株Ceh的生長(zhǎng)而復(fù)制。

M：1 kb marker；1～9：突變體；10：野生型菌株Ceh；11：陽(yáng)性對(duì)照 M：1 kb marker；Lanes 1-9：Transformants of C. eleocharidis：Lane 10：Wild type Ceh；Lane 11：Positive control 圖9 荸薺稈枯病菌轉(zhuǎn)化子雜交帶型分析結(jié)果Fig.9 Hybrid banding patterns analysis on transformants of C. eleocharidis

2.6 病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡鑒定

將病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子菌落或孢子懸浮液置于熒光顯微鏡下觀察。從圖10可看出，經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的突變體在熒光顯微鏡紫外激發(fā)光下發(fā)出熒光(綠光)，說(shuō)明農(nóng)桿菌的GFP基因已成功轉(zhuǎn)到荸薺稈枯病原菌中并得以表達(dá)。

2.7 病原菌菌株Ceh突變體的菌落形態(tài)觀察結(jié)果

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的6325.0個(gè)病原菌菌株Ceh轉(zhuǎn)化子與野生型Ceh菌落形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)突變體菌落表型發(fā)生明顯變化(圖11)，其中突變體C2 菌落形態(tài)異常(菌落形態(tài)變小)，突變體C1和C3菌落顏色發(fā)生變化(由灰色變?yōu)榛野咨虬咨?，突變體C4、C5、C7和C6菌絲密度變化明顯(菌落菌絲由疏變密)。說(shuō)明T-DNA的插入影響突變體形態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致突變體形態(tài)表現(xiàn)異常。

2.8 病原菌菌株Ceh突變體的致病性測(cè)定結(jié)果

本研究共測(cè)試6325.0個(gè)突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型菌株和多數(shù)Ceh突變體均能使荸薺莖稈產(chǎn)生水漬狀病斑，同時(shí)也獲得致病性缺陷突變體，其中，致病力喪失突變體4株，弱致病力突變體26株，致病力正常突變體和致病力缺陷突變體分別占總突變體數(shù)的99.53 %和0.47 %。從圖12可看出，致病力喪失的突變體為C189、C625、C51和C3638；弱致病力突變體為C4281和C2367，其所致病斑面積分別為3 mm×2 mm和4 mm×3 mm，明顯小于野生型菌株所致病斑面積(11 mm×5 mm)。說(shuō)明以上6個(gè)突變體的致病性相關(guān)基因受到了不同程度的破壞，從而使突變體致病力喪失或降低。

A、C：紫外光條件下的熒光顯微照相；B、D：明場(chǎng)條件下的顯微照相 A，C：Fluorescence microscopy image under ultraviolet light；B，D：Fluorescence microscopy image under bright field圖10 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化荸薺稈枯病菌獲得的轉(zhuǎn)化子熒光顯微鏡鑒定結(jié)果Fig.10 Fluorescence microscopy analysis of transformants of C. eleocharidis

圖11 突變體與野生型Ceh菌株的菌落形態(tài)比較Fig.11 Colony morphology comparison of wild type strain Ceh1 and the mutants

3 討 論

絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是研究植物病原真菌分子遺傳和基因功能的重要手段，而由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(ATMT)已成功應(yīng)用于Fusariumoxysporum、Aspergillusjaponicus、Pseudocercosporafijiensis和Sporisoriumscitamineum等絲狀真菌[9-12]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化相比其他幾種真菌轉(zhuǎn)化方法(PEG-MT、REMI和基因槍等)具有轉(zhuǎn)化受體類型多(如分生孢子、原生質(zhì)體、菌絲、甚至蘑菇的菌絲體組織等)、插入隨機(jī)性、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化效率高及T-DNA單拷貝率高等優(yōu)點(diǎn)[13]，從而使得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)成為建立覆蓋全基因組突變體庫(kù)的一個(gè)技術(shù)工具[10-11]。本研究運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化方法成功將含有綠色熒光蛋白(GFP)的雙元載體pEX4轉(zhuǎn)化到荸薺稈枯病菌野生型菌株Ceh中；通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化影響因子的優(yōu)化，獲得最佳轉(zhuǎn)化條件：共培養(yǎng)基中AS濃度為300 μmol/L，農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，病菌孢子濃度為107個(gè)/mL，誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH 5.6，共培養(yǎng)時(shí)間為72 h，共培養(yǎng)濾膜為硝酸纖維素膜；通過(guò)條件優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化子數(shù))可達(dá)600～700個(gè)/107孢子。

農(nóng)桿菌與病原菌混勻后進(jìn)行共培養(yǎng)，此階段是農(nóng)桿菌將自己的T-DNA往外向病菌運(yùn)輸，并融合到病菌基因組DNA的過(guò)程，AS在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌激活Vir基因，促進(jìn)T-DNA整合到病菌基因組DNA[13，15]。本研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌與病菌共培養(yǎng)時(shí)AS的有無(wú)是關(guān)鍵，在缺乏AS的情況下，未獲得轉(zhuǎn)化子。此外，共培養(yǎng)時(shí)間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素，但不同真菌由于自身生長(zhǎng)特點(diǎn)不同，共培養(yǎng)時(shí)間也存在較大差異，如在農(nóng)桿菌對(duì)木霉的遺傳轉(zhuǎn)化中，在共培養(yǎng)12 h條件下未獲得轉(zhuǎn)化子，共培養(yǎng)24 h僅獲得少量轉(zhuǎn)化子，共培養(yǎng)48 h 的轉(zhuǎn)化效率最高，而共培養(yǎng)時(shí)間高于48 h導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低[16]。而在農(nóng)桿菌介導(dǎo)黃瓜炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化中，用較短的共培養(yǎng)時(shí)間(24 ℃黑暗24 h)其轉(zhuǎn)化效率反而更高。這是由于共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的菌絲越長(zhǎng)，不容易從共培養(yǎng)的尼龍膜上洗掉，因而影響轉(zhuǎn)化效率[17]。本研究認(rèn)為，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)(96 h)，共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率越高；在一定的真菌孢子濃度(107個(gè)/mL)下，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化子數(shù)量增加過(guò)多，均不利于單菌落挑取，因此本研究選擇的最適共培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

圖12 病原菌菌株Ceh突變體離體莖稈致病性的測(cè)定結(jié)果Fig.12 Pathogenicity test of the strain Ceh mutants in vitro stem

自綠色熒光蛋白GFP出現(xiàn)起，GFP及其衍生物已作為標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域。GFP在絲狀真菌中主要有幾個(gè)方面的應(yīng)用：病原菌入侵寄主和致病等互作過(guò)程、調(diào)查真菌孢子中細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)和分裂過(guò)程及觀察病原菌調(diào)控蛋白的移位等[18-21]。本研究采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法成功將GFP基因?qū)胼┧j稈枯病菌的基因組DNA中，因此，GFP蛋白可作為報(bào)告基因應(yīng)用于荸薺稈枯病菌與寄主的互作研究中；通過(guò)多批次農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體庫(kù)，篩選表型和致病性缺陷突變體，可為突變基因克隆和功能分析提供研究材料。

4 結(jié) 論

成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)荸薺稈枯病菌高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并通過(guò)構(gòu)建T-DNA插入突變體庫(kù)，篩選得到表型和致病性缺陷突變體，可作為開(kāi)展荸薺稈枯病菌基因功能和病菌與寄主互作研究的參考依據(jù)。