嚴(yán)重鈣脅迫下接種AM真菌無益于緩解玉米苗期的鈣毒害

冉 瓊，鐘章成，杜道林

(1.重慶理工大學(xué)，重慶 巴南401320；2.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000；3.西南大學(xué) 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 北碚 400715；4.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

0 引 言

叢枝菌根(AM)真菌是一類能與陸地上約80%植物形成共生體的土壤微生物[5]，大多數(shù)植物的根系可與之形成良好的互惠共生關(guān)系，能促使植物吸收營養(yǎng)，促進植物生長，還能增強植物的抗病能力[6-7]、抗旱性[8]、抗鹽性[9]、抗溫度脅迫[10]及抗重金屬脅迫[11]等。但目前關(guān)于AM 真菌和鈣毒害效應(yīng)相關(guān)性的研究還鮮有報道。種植玉米是解決西南喀斯特山區(qū)糧食問題的可行途徑，而如何提高玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量是玉米生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵問題。本研究利用溫室盆栽試驗，探討了AM真菌對高鈣脅迫下玉米生長、光合及生化特性等的影響，旨在探討高鈣脅迫對玉米的毒害效應(yīng)及AM真菌對高鈣脅迫的緩解作用，研究結(jié)果可為評價喀斯特地區(qū)AM真菌對高鈣土壤中的植物的促生效應(yīng)及其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 AM真菌接種體。菌種摩西球囊霉(Glomusmosseae)，購買自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所，接種劑為經(jīng)白三葉草繁殖后產(chǎn)生的菌根菌孢子、根外菌絲體及根際土壤(含有相應(yīng)宿主植物根段)，約300個孢子· 20g-1。

1.1.2 宿主植物。宿主植物為玉米(ZeamaysL.)，種子來自重慶市酉陽縣巖溶山區(qū)農(nóng)戶提供的自選種，先經(jīng)10% H2O2消毒10 min，接著用無菌水洗凈后置于滅菌后的培養(yǎng)皿(皿底放無菌濕潤的三層濾紙)，再將培養(yǎng)皿放于25 ℃黑箱里催芽，2天后，挑選狀況一致的種芽備用。

1.1.3 培養(yǎng)基質(zhì)與容器。培養(yǎng)基質(zhì)為土沙1∶4(W∶W)混合物。土壤為巖溶地段的石灰土(pH值6.81，含有機質(zhì)26.8 g·kg-1，堿解氮68 mg·kg-1，速效鉀108 mg·kg-1，交換性鈣2.326 g·kg-1，全鉀14.62 g·kg-1，全磷0.46 g·kg-1，全氮1.34 g·kg-1)，取自重慶北碚雞公；土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，過1 mm篩，在溫度124 ℃，壓力0.14 MPa高壓滅菌鍋下連續(xù)滅菌2 h，晾干，再與相同方式下滅菌晾干的干凈河沙均勻混合備用。培養(yǎng)容器采用高16 cm，上口直徑19 cm，下口直徑13 cm的塑料盆，先于0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡30 min，再清洗干凈、晾干。

1.2 試驗設(shè)計

試驗包括兩因素，接種處理和鈣處理，接種處理為接菌和不接菌，鈣處理為對照鈣處理和高鈣處理。采用兩因素完全隨機設(shè)計，兩因素兩水平，共4個處理：對照不接菌處理(C)；對照接菌處理(C+AMF)；高鈣不接菌處理(H)；高鈣接菌處理(H+AMF)，每個處理種植7盆，隨機擺放于大棚內(nèi)。

于2015年4月8日在西南大學(xué)生態(tài)園的大棚內(nèi)進行播種，為保障植物正常生長，播種前將復(fù)合肥200 mg·kg-1(N∶P∶K=26∶12∶10)混入基質(zhì)中作基礎(chǔ)養(yǎng)分。試驗分為對照和高鈣處理，對照處理為培養(yǎng)基質(zhì)不加外源鈣，高鈣處理為培養(yǎng)基質(zhì)添加外源鈣(無水氯化鈣以溶液形式添加混勻)，達到1.0 g·kg-1[12-13]的鈣離子濃度(不含基質(zhì)中的鈣本底值)。鈣設(shè)置完成后，裝盆，預(yù)計每盆裝2.5 kg基質(zhì)。先將2.0 kg基質(zhì)裝入培養(yǎng)容器，然后添加滅菌接種物15 g(不接菌處理，同時添加10 ml 15 g接種物的過濾液，保持其它菌群一致)或接種物15 g(接菌處理)于已盆裝基質(zhì)表面，將5粒玉米種芽植入盆裝基質(zhì)中，最后將余下的0.5 kg基質(zhì)平鋪其上，接種劑與土表距離約2 cm。裝盆過程完成后澆水，盆中基質(zhì)含水量達到20%(絕對含水量)為止。試驗過程均采用去離子水澆灌，每天稱重維持20%的土壤含水量。出苗7天后間苗，每盆留苗2株，試驗開始至第6周時測定各指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 玉米幼苗光合參數(shù)及生長指標(biāo)的測定。于晴朗的上午9:00時，采用便攜式光合測定儀Li-6400(LI-COR，USA)測定玉米幼苗第2-3張完全展開葉片的光合參數(shù)。測定時光量子通量密度(PED)為1 200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為(470±10)μmol·mol-1，溫度為26 ℃，相對濕度為65%，葉室配備LED紅藍光源。測定完成后，用直尺量取植株株高，再將花盆連同植株浸入水中，小心取出植株，先用自來水沖掉根部土壤和沙礫，再用蒸餾水緩緩洗凈植株表面，最后用吸水紙吸干植株表面水分，并將其帶回實驗室。將各處理3-5個植株進行根、莖、葉器官分離，放至105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，70 ℃烘干72 h后進行稱重，根、莖、葉生物量之和為總生物量，莖、葉生物量之和為地上生物量，根生物量與地上生物量之比即為根冠比。

1.3.2 玉米幼苗根系侵染率的測定。根系侵染率的測定參照Phillips和Hayman的方法[14]，將切成1 cm的玉米小根段，用曲利苯藍0.05%濃度的染色液染色，菌根侵染率為侵染根段長占總根段長的百分比。

1.3.3 玉米幼苗葉生化指標(biāo)的測定。脯氨酸的測定—磺基水楊酸法，參照章家恩[15]方法進行。

可溶性糖的測定參照張志良等[16]的比色法進行。

丙二醛含量的測定參照章家恩[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，LSD多重比較5%水平下檢驗不同處理平均值間的差異顯著性，采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣脅迫下AM真菌對玉米幼苗生長和光合參數(shù)的影響

由表1可知，高鈣處理下玉米幼苗的菌根侵染、總生物量、地上生物量、株高及根冠比均顯著低于對照處理(P<0.05)，表明高鈣顯著抑制了玉米根系的侵染能力和生長。對照條件下，接菌處理顯著增加玉米幼苗總生物量、地上生物量、株高，分別提高了31.8%、40.8%和10.3%(P<0.05)；然而，高鈣條件下，接菌處理未使玉米幼苗的總生物量、地上生物量、株高及根冠比產(chǎn)生顯著變化。

表1 不同處理下玉米幼苗的菌根侵染率和生長特征Table 1 The AMF colonization ratio and growth of maize seedlings under different treatments

由圖1可知，與對照處理相比，高鈣處理顯著降低了玉米幼苗的凈光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度(P<0.05)，表明高鈣脅迫抑制了玉米幼苗的光合能力。對照條件下，接菌處理分別使玉米幼苗凈光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度顯著提高22.3%、15.4%、32.2%(P<0.05)；然而，高鈣條件下，接菌處理未對玉米幼苗的光合參數(shù)產(chǎn)生顯著影響。

圖1 不同處理下玉米幼苗的光合參數(shù)Fig.1 The photosynthetic characteristics of maize seedlings under different treatments

2.2 鈣脅迫下AM真菌對玉米幼苗可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的影響

可溶糖含量是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對照條件下，接菌處理顯著提高了玉米幼苗可溶性糖含量(P<0.05)；高鈣脅迫顯著降低了玉米幼苗的可溶性糖含量(P<0.05，圖2)；高鈣條件下，接菌處理未使玉米幼苗的可溶性糖含量產(chǎn)生顯著變化。

圖2 不同處理下玉米幼苗可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的影響Fig.2 The soluble sugar,proline and MDA contents of maize seedlings under different treatments

脯氨酸含量大小可以反映植物受害程度的高低，與對照處理相比，高鈣處理下玉米幼苗的脯氨酸含量顯著增加，表明高鈣處理下玉米幼苗的受害程度遠高于對照處理(圖2)。對照與高鈣脅迫下，接菌處理均對脯氨酸含量影響不顯著。

丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量越低細胞膜的完整性和穩(wěn)定性越好。鈣濃度增加，丙二醛有降低趨勢，鈣在一定程度上能穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)。對照鈣處理下，接菌處理較未接菌處理玉米幼苗的丙二醛含量理顯著下降(P<0.05)(圖2)，表明AM真菌能夠使植物細胞膜保持更加好的完整性和穩(wěn)定性；高鈣下接菌處理未對丙二含醛含量產(chǎn)生顯著影響。

3 討 論

AM真菌是一類能與絕大部分植物的根系形成互惠共生體的微生物。魏源等[29-30]發(fā)現(xiàn)，AM真菌的生態(tài)學(xué)功能與喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的限制因子間有良好的耦合關(guān)系，AM真菌與宿主植物之間有著雙向的選擇性，侵染率是彼此間親和力的體現(xiàn)，親和力好，則侵染率高；親和力差，則侵染率低。本研究表明，典型喀斯特土壤，鈣含量超過中鈣水平鈣脅迫的植株相對于高鈣脅迫的植株更容易與AM真菌形成共生體。鈣濃度增加對AM真菌不規(guī)則發(fā)育具有負面影響，能顯著降低AM真菌不規(guī)則生長周期的主要階段，包括孢子萌發(fā)、萌發(fā)菌絲伸長、根定植、根外菌絲發(fā)育和孢子形成，但不能完全抑制其生長[31]。

AM真菌在鹽脅迫下能提高玉米生長和光合能力[32]，我們的數(shù)據(jù)表明，過高鈣水平不利于玉米植株的生長，這種效應(yīng)在菌根中比在非菌根中更強烈，這可能與菌根分配相當(dāng)一部分碳以維持真菌代謝有關(guān)[33-34]。叢枝菌根定植在過高鈣情況下不能提供植物更好的生長，這一結(jié)果與許多表明叢枝菌根共生在其他幾種非生物脅迫下對植物生長有益的研究并不一致[35-37]。Hoffland等[38]和Van Scholl等[39]報道稱，菌根內(nèi)真菌從巖石中吸收鈣的能力非常小，由此可能緩解鈣毒效應(yīng)。

高鈣會導(dǎo)致礦物質(zhì)養(yǎng)分生物利用度低，尤其是磷[40]和鐵[41]，因此，這些缺陷會影響植物根部和葉片的代謝過程[42]。糖是一種重要的代謝產(chǎn)物，植物在各種應(yīng)激因子的作用下，利用糖進行防御反應(yīng)，環(huán)境壓力誘導(dǎo)可使可溶性糖含量變化，本研究結(jié)果顯示，高鈣顯著降低了可溶性糖含量。對照鈣處理下AM真菌促進了可溶性糖的積累，AM真菌需要從宿主植物獲得糖分來促進自身生長[43]，也會促進植株體內(nèi)淀粉的分解[44]，因此能使宿主植物可溶性糖含量增加，但高鈣脅迫下，AM真菌未對可溶性糖含量產(chǎn)生顯著影響。

脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物，許多植物在鹽脅迫的條件下積累脯氨酸可作為無毒和保護性的滲透物來維持滲透平衡[45-47]，因此其積累量的高低可以反映植物抗逆性的強弱。AM真菌還可通過增加宿主植物體內(nèi)脯氨酸的積累量，提高植物的耐鹽性[48]。本研究結(jié)果顯示，鈣濃度增加促使脯氨酸含量顯著提高，但AM真菌對脯氨酸含量的積累無顯著影響。

MDA含量是評估氧化膜損傷的有效手段[49-50]，脂質(zhì)過氧化作用被認為是植物抗非生物脅迫的關(guān)鍵過程之一。本研究發(fā)現(xiàn)，對照鈣處理下，叢枝菌根可以減輕膜脂過氧化。菌根定植對根系保護可能與誘導(dǎo)活性氧清除系統(tǒng)減少活性氧生成有關(guān)，在應(yīng)激反應(yīng)中最常見的解毒ROS合成器的機制中，POD誘導(dǎo)已經(jīng)在幾項研究中得到報道[51]。

綜上所述，過高鈣含量土壤基質(zhì)抑制了植物的生長和光合生理等過程，AM真菌在部分喀斯特土壤中仍能促進植物的生長、光合及代謝過程，鈣過高環(huán)境下，AM真菌不能促進植物的生長生理過程，一方面與高鈣脅迫抑制了菌根真菌的生長和生理過程，菌根真菌沒有參與鈣的吸收、對鈣毒效應(yīng)的緩解效應(yīng)不顯著有關(guān)，另外，不同土壤環(huán)境和菌種會導(dǎo)致不同的接種效應(yīng)，且不同菌種與寄主間侵染時期及親和性也使接種效應(yīng)具有差異性，玉米根際AM真菌豐富多樣[52]，種類不同，促進植物生長發(fā)育的效果有差異[53]。

本研究探究了土壤高鈣對AM真菌和寄主植物之間的相互作用的影響，過高鈣濃度抑制了植物的生長及光合等生理過程，也對AM真菌的定植產(chǎn)生了影響，AM真菌定植未顯著緩解過高鈣毒效應(yīng)。由于目前高鈣脅迫下的菌根效應(yīng)關(guān)注比較少，有關(guān)AM 真菌減緩鈣離子對植物毒害作用的機制，目前尚無定論，對于喀斯特地區(qū)鈣與土壤AM植物系統(tǒng)相互作用的因果關(guān)系仍有許多未解之謎。異質(zhì)性是巖溶生境中土壤的重要特點，多重脅迫往往在該生境中共同存在，因此探討異質(zhì)生境與多重脅迫下植物的適應(yīng)性及菌根效應(yīng)，是今后研究需努力的方向。