細菌耐藥性的拉曼光譜快速檢測研究進展

張 萍， 褚東辰， 陳可仁， 劉泳麟， 羅瑞鶴， 劉 洋， 鄭大威

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院， 北京 100124)

抗生素(antibiotics)是治療細菌性感染的重要藥物，伴隨著抗生素的發(fā)展，抗生素濫用誘發(fā)的細菌耐藥性問題變得日益突出，使得臨床上常用抗生素的可選擇性降低，增加了治療難度和治療成本[1]. 全國耐藥細菌監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的2017年全國細菌耐藥監(jiān)測報告顯示，某些致病菌對其治療使用的抗生素的耐藥檢出率已達五成以上，例如肺炎鏈球菌對紅霉素的耐藥率高達95.0 %，甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌在中國的平均檢出率為76.0%，大腸埃希菌對頭孢曲松或頭孢噻肟的耐藥率已達54.2%，對左氧氟沙星或環(huán)丙沙星的耐藥率全國平均為51.0%，鮑曼不動桿菌對亞胺培南或美羅培南的耐藥率全國平均為56.1%[2]. 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，抗生素耐藥性每年造成70萬人死亡，如果該問題無法得到解決的話，到2050年，由抗生素耐藥引發(fā)的死亡人數(shù)將達到1 000萬人[2].

抗生素治療的效果受到細菌抗生素耐受性的影響. 細菌耐藥性的快速檢測是臨床上快速診斷病因、合理使用抗生素和掌握耐藥性產(chǎn)生過程的關(guān)鍵，對于保護人類健康具有重要意義. 然而，由于細菌耐藥性的產(chǎn)生機制復(fù)雜多樣，分為天然耐藥性和誘導(dǎo)耐藥性，與細菌產(chǎn)生滅活酶、改變細胞壁的通透性、遺傳突變、抗生素作用靶點的改變、增加藥物外排以及生物被膜的形成等都有密切的關(guān)系，這些因素增加了細菌抗生素耐藥性快速檢測的難度. 現(xiàn)有依賴培養(yǎng)的方法在應(yīng)對食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的公共突發(fā)事件時，仍然無法滿足臨床快速診斷的不同分析要求.

拉曼光譜技術(shù)是對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種光譜分析方法. 作為一種振動光譜技術(shù)，拉曼光譜具有光譜學(xué)快速檢測的優(yōu)點，通過特定的光譜模式識別，高特異性地觀察生物分子的變化，同時不受水的干擾，非常適合生物醫(yī)學(xué)體系的研究. 在過去的10年里，拉曼光譜技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用研究獲得了越來越多的關(guān)注. 不同種屬的細菌細胞具有不同的結(jié)構(gòu)信息，拉曼光譜作為反映生物大分子特征振動信息的“指紋光譜”技術(shù)，在微生物檢測、鑒別、分類、代謝等領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得豐碩的研究成果，體現(xiàn)出較高的特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度[3]. 在抗生素治療過程中，通過監(jiān)測細菌的拉曼光譜信息變化，并且結(jié)合多元統(tǒng)計分析，可實現(xiàn)對細菌耐藥性和敏感性的快速定性鑒別[4-5]. 拉曼光譜與顯微技術(shù)的結(jié)合，在免培養(yǎng)的條件下即可對單細胞進行檢測，大大縮短樣本前處理和檢測時間，同時為細菌耐藥的細胞異質(zhì)性檢測提供快速的技術(shù)手段[6-7]. 拉曼光譜技術(shù)與穩(wěn)定同位素標(biāo)記相結(jié)合，為細菌耐藥譜及耐藥程度的定性和定量分析檢測提供了技術(shù)支撐[8]. 近些年，表面增強拉曼光譜技術(shù)以及儀器的小型化、便攜化的發(fā)展，大大提高了檢測的靈敏度，為實現(xiàn)致病菌及耐藥性的現(xiàn)場、快速檢測提供了巨大的發(fā)展空間[9-10]. 本文將對拉曼光譜的原理和用于細菌檢測的拉曼光譜技術(shù)進行簡單的介紹，重點圍繞近5年拉曼光譜技術(shù)在細菌耐藥性檢測方面的研究進展進行綜述.

1 細菌耐藥性的檢測方法

抗生素耐藥性是指在短時間內(nèi)細菌細胞暴露于致死濃度的抗生素處理時仍然能夠存活下來. 細菌耐藥性的產(chǎn)生受眾多因素的影響，耐藥機制復(fù)雜多樣，導(dǎo)致了耐藥菌快速檢測的難度增加[1]. 目前，細菌的耐藥性檢測主要依賴于培養(yǎng)法、自動儀器檢測、分子檢測及酶實驗等. 其中傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)法，包括分離培養(yǎng)、生化鑒定、肉湯稀釋法、紙片擴散法、E-test等，具有較高的準(zhǔn)確度，但是培養(yǎng)過程耗時(2～3 d)、靈敏度低，這期間醫(yī)生只能依靠經(jīng)驗性治療，并且對于難以培養(yǎng)的細菌無能為力，亦無法揭示耐藥機制. Vitek-2、Pheonix、Microscan等自動檢測儀器主要運用折點敏感試驗的原理，半定量測定抗菌藥物的最小抑菌濃度值(minimal inhibit concentration, MIC)，依賴于細菌培養(yǎng)過程，對新的耐藥株無法檢測. PCR、ELISA等分子生物學(xué)和免疫學(xué)的技術(shù)，可在短時間內(nèi)獲得結(jié)果，但PCR技術(shù)由于操作易污染，很難避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，ELISA實驗抗體間可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)，這些弊端至今仍未克服. 基因芯片檢測和質(zhì)譜技術(shù)盡管表現(xiàn)出了高靈敏度和高特異性，卻因為受限于成本昂貴和操作繁復(fù)的缺點，在應(yīng)對食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公共突發(fā)事件時，無法滿足臨床診斷等各種分析的不同要求[11]. 目前，盡管圍繞細菌耐藥性的基礎(chǔ)研究已有大量文獻報道，通過檢測細菌感染的標(biāo)志物能快速篩查預(yù)警，也有些試劑盒通過FDA的批準(zhǔn)，但細菌對多數(shù)抗生素的耐藥機理至今仍未徹底闡明，從而限制了基因檢測法的廣泛應(yīng)用. 因此，臨床上急需一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的新方法，用于致病菌及耐藥性的有效監(jiān)測.

2 細菌檢測的拉曼光譜技術(shù)

2.1 常規(guī)拉曼光譜技術(shù)

拉曼散射(Raman scattering，RS)效應(yīng)由印度科學(xué)家Raman于1928年發(fā)現(xiàn). 光照射到物質(zhì)上會發(fā)生彈性散射和非彈性散射，其中大部分的光子發(fā)生彈性散射，又稱為瑞利散射，僅約為入射光10-6的光子發(fā)生非彈性散射，在這個過程中，散射光子的頻率小于入射光子的頻率，稱為斯托克斯線(Stokes)，散射光子的頻率大于入射光子的頻率，稱為反斯托克斯(anti-Stokes)，Stokes線和反Stokes線統(tǒng)稱為拉曼譜線，在瑞利線的兩側(cè)等距離分開. 由于在通常情況下，絕大多數(shù)分子處于振動能級基態(tài)，因此，Stokes線的強度遠遠強于反Stokes線，被認為是常規(guī)拉曼光譜(normal Raman spectroscopy, NRS). 作為一種振動光譜技術(shù)，拉曼光譜具有與紅外光譜相似并互補的特點，通過特定的光譜模式識別，高特異性地觀察分子的結(jié)構(gòu)與變化. 將振動光譜技術(shù)用于微生物的檢測研究始于1950—1960年，最初采用的是紅外光譜技術(shù)，但紅外光譜易受水的干擾，因而限制了它在生物樣品分析上的應(yīng)用. 拉曼光譜檢測可以水為介質(zhì)，使樣品在接近自然、活性狀態(tài)下研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化，對樣品具有直接、無損檢測的特點，因而更適用于生物體系的研究. 但是由于常規(guī)拉曼光譜信號弱、靈敏度低、設(shè)備高昂等，將它用于細菌研究的受限因素還比較多. 之后的10年間，隨著激光器的發(fā)展，將拉曼光譜用于細菌中核酸、細胞色素、酶、光合蛋白、膜蛋白等生化組分的研究陸續(xù)被報道.

理論上，不同種屬細菌細胞的結(jié)構(gòu)信息與分子組成各不相同，拉曼光譜是反映生物大分子結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)和脂類、糖類、核酸等)特征振動信息的疊加圖譜，因此，通過拉曼信號記錄細菌細胞的大分子結(jié)構(gòu)組成的變化，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法可以快速區(qū)分不同種屬的細菌. 然而，由于普通拉曼信號較弱，生物本身存在熒光干擾，獲得理想的細菌拉曼信息存在較大的困難，因此，采用常規(guī)拉曼光譜檢測主要還是依賴培養(yǎng)的方法收集大量的細菌細胞，這樣雖然擺脫了煩瑣的生化鑒定步驟，但實際上并未達到真正快速檢測的目的.

2.2 表面增強拉曼光譜技術(shù)

將吸附在特殊制備的一些金屬良導(dǎo)體表面或納米貴金屬溶膠中的被測分子的拉曼信號顯著放大的現(xiàn)象稱為表面增強拉曼散射效應(yīng)(surface enhanced Raman scattering, SERS). SERS技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度及特異性. 1998年，Efrima等[12]采用銀溶膠首次利用SERS技術(shù)實現(xiàn)對革蘭氏陽性菌和陰性菌的鑒定，此后，SERS在細菌檢測、鑒定、分類方面的應(yīng)用研究得到了迅速的關(guān)注. 目前，采用的增強基底除了非標(biāo)記的納米級金屬粗糙表面、納米金、銀溶膠外[10，12-13]，還包括基于免疫標(biāo)記技術(shù)的納米增強探針、微陣列結(jié)構(gòu)等[14-15]. 非標(biāo)記的SERS檢測，增強基底合成方法簡單、操作簡便、靈敏度高，可實現(xiàn)對未知細菌的快速鑒別，大大縮短了檢查時間，被應(yīng)用于不同種屬細菌的鑒別[10，12-13]，監(jiān)測細菌不同生長階段引起的代謝變化等[16-17]. 使用激光光鑷拉曼光譜技術(shù)(laser tweezers Raman spectroscopy, LTRS)表征不同生長階段大腸桿菌的拉曼指紋特性，發(fā)現(xiàn)DNA和RNA的拉曼峰強度隨著細菌的生長逐漸降低，而蛋白質(zhì)特異性的拉曼振動則以不同的速率增加[18]. Zhou等[13]采用銀納米顆粒作為增強基底檢測飲用水中的細菌污染狀況，發(fā)現(xiàn)銀顆粒覆蓋在細菌的細胞壁，細菌的拉曼信號得到極大增強，該方法檢測時間短、流程簡單、靈敏度高、樣品量少，能夠?qū)Υ竽c桿菌和表皮葡萄球菌進行快速區(qū)分. Kairyte 等[16]采用非標(biāo)記的SERS技術(shù)快速檢測李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌，將細菌表面的腺嘌呤和半胱氨酸的拉曼信號強度作為依據(jù)，實現(xiàn)了對3種細菌的快速鑒別. Zheng等[10]采用以金溶膠為增強基底的非標(biāo)記方法，利用便攜式拉曼光譜儀對復(fù)合菌污染類型的快速篩查可在6 h內(nèi)完成. SERS具有較高的檢測靈敏度，采用非標(biāo)記的方法對活菌和死菌進行快速檢測，發(fā)現(xiàn)活的菌體具有較強的拉曼信號，而死菌檢測不到，與我實驗室的觀察結(jié)果相一致[10，17].

增強基底的改良、修飾與功能化不斷提升檢測的靈敏度和特異性，只需要少量菌體，如每毫升溶液中只需幾十到幾百個細菌，即可獲得高質(zhì)量的拉曼信號，免疫標(biāo)記的納米增強探針在特異性檢測中發(fā)揮著重要的作用. Guven等[19]將生物素標(biāo)記的抗大腸桿菌抗體固定在親和素包被的納米磁珠上分離濃縮大腸桿菌，用2-硝基苯甲酸作為拉曼探針的棒狀金納米顆粒增強基底對大腸桿菌進行定量SERS檢測，定量限可達24 CFU/mL，總耗時不超過70 min. Kearns等[20]采用凝集素修飾納米磁珠的方法收集細菌菌體，然后使用SERS活性基底特異性檢測病原菌，對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低檢測濃度可達10 CFU/mL，還可實現(xiàn)對同一樣品中這3種混合菌的同時快速檢測. Yuan等[21]采用4-巰基苯基硼酸(4-MPBA，作為拉曼標(biāo)記和內(nèi)標(biāo))修飾的金鍍銀氧化石墨烯(Au@Ag-Go)納米復(fù)合物作為增強基底，并結(jié)合抗菌肽功能化修飾納米磁珠的方法收集細菌菌體，對大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的最低檢測濃度可達10 CFU/mL，同時可用于混合感染的檢測[20-21]. SERS技術(shù)并成功用于尿路感染病原菌的快檢，可快速識別大腸桿菌、變形桿菌和克雷伯菌，準(zhǔn)確率達到94%，靈敏度大于95%，特異性達到99%，總耗時1 h，包括從尿液中離心濃縮收集檢測病原菌[22-23].

SERS具有更高的信噪比和檢測靈敏度，隨著增強基底的不斷改良與完善，甚至可以達到單分子水平的檢測，在接近自然狀態(tài)下，直接、無損傷地研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化，將使其應(yīng)用于活細胞等復(fù)雜系統(tǒng)的檢測越來越成熟.

2.3 共聚焦拉曼顯微光譜技術(shù)

顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜技術(shù)和顯微分析技術(shù)結(jié)合起來的一種應(yīng)用技術(shù). 1975年，開創(chuàng)性地將拉曼檢測應(yīng)用到顯微分析技術(shù)研究中，1990年，第一臺共聚焦拉曼顯微光譜儀(confocal Raman microspectroscopy, CRMS)誕生，1998年首次被應(yīng)用于體外單細胞的檢測研究. 顯微拉曼光譜具有微觀、原位、多相態(tài)、穩(wěn)定性好和空間分辨率高等特點，能夠從樣本中直接分離出單個致病菌進行檢測，是一種免培養(yǎng)、非標(biāo)記的方法，大大縮短樣本前處理和檢測時間，尤其適用于體外難以培養(yǎng)的微生物，做到真正的快速檢測[24]. 此外，共聚焦拉曼顯微光譜儀可實現(xiàn)逐點掃描，獲得高分辨率的三維圖像，即拉曼成像技術(shù)，廣泛被用于藥物作用靶點及作用動力學(xué)分析方面.

共聚焦拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)，及其與表面增強拉曼散射效應(yīng)的結(jié)合，使其具有超高的靈敏度和空間分辨率，不需要對生物材料進行標(biāo)記，即可從單細胞及亞細胞水平收集生物大分子的拉曼信息，被廣泛用于水樣[25]、生物樣品[26-27]、食品[28]、環(huán)境[29]中的微生物鑒定，不僅能夠鑒別不同種屬、不同亞種細菌細胞間的差異，而且還可檢測同一菌株在不同生長時期生理狀態(tài)上的細微差異，以及在藥物作用下對細菌生化代謝的影響[30].

生物材料在檢測時容易受到自身熒光的干擾. 激發(fā)波長小于260 nm的紫外共振拉曼光譜技術(shù)(UV resonance Raman spectroscopy, UVRRS)能有效避免生物背景熒光的產(chǎn)生，可將菌體的拉曼信號放大幾個數(shù)量級. 通過選擇特定的激發(fā)波長對于表征細菌中特定的大分子非常有效，如231 nm的激發(fā)波長能特異性檢測芳香族氨基酸，251 nm的激發(fā)波長可大量獲取核酸的拉曼信號. 此外，共振拉曼光譜(resonance Raman spectra, RRS)、相干反斯托克斯拉曼光譜(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)、尖端增強拉曼光譜(tip enhanced Raman scattering, TERS)、受激拉曼光譜(stimulated Raman scattering, SRS)也被用于微生物的檢測研究. 隨著CCD技術(shù)、3D技術(shù)及光纖探頭的發(fā)展，研究的重點逐漸轉(zhuǎn)向活體組織的in vivo檢測研究，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)衛(wèi)生等領(lǐng)域中逐漸彰顯出優(yōu)勢.

3 拉曼光譜檢測細菌耐藥性

細菌耐藥性的快速鑒別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待攻克的重要難題. 目前，培養(yǎng)法仍是主流通用標(biāo)準(zhǔn)，但對于臨床常見致病菌，培養(yǎng)法耗時長，難以揭示耐藥機制，對于難以培養(yǎng)或生長緩慢的細菌無能為力. 臨床上為了指導(dǎo)“精準(zhǔn)用藥”“個性化用藥”，急需細菌耐藥性及其耐藥機制檢測的快檢技術(shù). 近些年來，隨著拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展以及與其他技術(shù)的融合，在抗生素耐藥性領(lǐng)域取得了突破性的進展，為細菌耐藥性研究提供了巨大的發(fā)展空間.

3.1 鑒定區(qū)分耐藥菌與敏感菌

大量研究報道，抗生素耐藥菌和敏感菌相比，分子結(jié)構(gòu)上存在差異，通過收集二者的拉曼光譜信息并結(jié)合多元統(tǒng)計分析，可實現(xiàn)對耐藥菌和敏感菌的快速區(qū)分. 德國耶拿大學(xué)的Popp課題組在細菌及耐藥性檢測方面取得豐碩的研究成果，提出采用拉曼光譜進行藥物診斷的基本概念，拉曼光譜在尿路感染病人體液中細菌的檢測和識別的應(yīng)用，以及抗生素耐藥或敏感細菌的快速光譜定性和定量檢測分析等[30].

在萬古霉素敏感性腸球菌中，萬古霉素通過氫鍵與新生細胞壁中肽聚糖五肽前體D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合，阻止細胞壁的進一步合成，導(dǎo)致細胞死亡，而在抗性菌中，抗生素觸發(fā)了D-丙氨酰-D-乳酸末端的合成，減少與這種新的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的結(jié)合，因此，萬古霉素處理時耐藥菌可以繼續(xù)存活，不會導(dǎo)致細胞死亡. 用萬古霉素處理糞腸球菌敏感菌株ATCC 29212和抗性菌株ATCC 51299半小時后，拉曼光譜可檢測到藥物誘導(dǎo)的變化，結(jié)合偏最小二乘法回歸和線性判別分析建立分類模型，能可靠地區(qū)分抗生素處理和未經(jīng)處理的細菌，在3.5 h內(nèi)表征出腸球菌對萬古霉素的耐藥性，同時在沒有任何菌株信息的情況下，準(zhǔn)確地從2種不同的腸球菌中識別出耐萬古霉素腸球菌，對臨床上抗性菌株的檢測具有參考應(yīng)用價值[31].

3.2 耐藥程度的檢測

MIC即抗菌藥物在18～24 h內(nèi)體外抑制培養(yǎng)病原菌生長的最低藥物濃度，目前是評價藥物抗菌活性和臨床制定抗菌治療方案的主要參考依據(jù). 然而，耐藥性存在細胞異質(zhì)性差異，而MIC檢測是基于被測細菌細胞具有一致性的特征而設(shè)計，因此，具有一定的局限性. 徐健等[5]提出基于“拉曼組”變化的細菌耐藥性快檢技術(shù)，以大腸桿菌為研究對象，定量考察了抗生素、醇類、重金屬等化學(xué)藥物在多個劑量、給藥時間、細胞抗性條件下大腸桿菌的拉曼組變化，以表征其耐藥性；采用穩(wěn)定同位素的標(biāo)記(D2O)與單細胞顯微拉曼光譜相結(jié)合的手段，對微生物的代謝過程進行精確的表征，根據(jù)2 040～2 300 cm-1波段的碳氘振動變化，可在單細胞水平監(jiān)測藥物對細胞的抑制作用[8]，據(jù)此可用于快速定量評價藥物的MIC，對變形鏈球菌耐藥性的檢測僅需幾個小時，該方法還能用于定量評估不同細胞對藥物的異質(zhì)性差異，對于治療隱匿性或復(fù)發(fā)感染具有重要意義[8，32]. 非標(biāo)記的方法因具有簡單、快捷、實時等優(yōu)點被廣泛使用. Germond等[33]采用非標(biāo)記的方法，以實驗室篩選的對不同抗生素產(chǎn)生抗性的11株大腸桿菌為研究對象，預(yù)測了大腸桿菌獲得性耐藥的拉曼光譜標(biāo)識，并且驗證了耐藥基因的表達與特征拉曼峰的峰強度具有顯著的相關(guān)性(P< 0.05).

3.3 藥物作用靶點分析

開發(fā)新的抗生素是對抗細菌耐藥性的主要手段. 新抗生素的研發(fā)面臨的巨大挑戰(zhàn)是檢測有多少藥物分子進入到細胞內(nèi)部，以及在細胞內(nèi)的分子靶點. 因此，研究抗生素在體內(nèi)的分布及藥代動力學(xué)是了解抗生素的作用機制以及細菌抗藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵問題. 有些細菌感染屬于胞內(nèi)感染，并且被細胞外基質(zhì)、生物膜等包被，因此，細菌接觸到的藥物濃度并不能真實地反映組織或器官中的藥物濃度. 藥物處理細菌后，將細菌冷凍干燥處理，采用顯微拉曼光譜技術(shù)收集單細胞拉曼光譜信息，通過顯微成像可測量細胞攝取藥物的動力學(xué)特征，檢測藥物進入細胞的數(shù)量以及藥物- 靶點相互作用的信息[34]，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法，通過建模預(yù)測未知藥物的作用靶點[4，34]. 使用LTRS檢測頭孢唑林處理后大腸桿菌的光譜變化，發(fā)現(xiàn)與DNA和RNA相關(guān)的拉曼峰的強度隨著細菌的生長逐漸降低，而蛋白質(zhì)特異性的拉曼振動則以不同的速率增加，這些潛在的拉曼標(biāo)記物可以用來鑒定大腸桿菌對抗生素治療的反應(yīng)[18]. Bernatova等[35]利用克林霉素處理表皮葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)DNA的拉曼信號無明顯變化，而經(jīng)環(huán)丙沙星處理后的DNA拉曼光譜強度下降，表明DNA發(fā)生了斷裂，據(jù)此可知環(huán)丙沙星對表皮葡萄球菌的作用靶點是DNA. Wang等[36]將氨芐西林和環(huán)丙沙星作用乳酸乳球菌，發(fā)現(xiàn)細菌與抗生素作用一段時間后，細菌細胞壁發(fā)生變化的同時與此所對應(yīng)的細菌的SERS光譜也會隨著抗生素不同的作用方式而出現(xiàn)差異，借助于主成分分析可以使這些差異更加可視化. 由于藥物作用引起的細菌代謝的改變有時很難在拉曼光譜中清晰地可視化，因此通常需要將拉曼數(shù)據(jù)與多變量分析相結(jié)合. Neugebauer等[37]使用UVRRS檢測芽孢桿菌和表皮葡萄球菌在氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、莫氟沙星)不同濃度處理時的細菌應(yīng)答，通過比較處理組和未處理組的光譜差異和PCA-HCA分析，發(fā)現(xiàn)光譜上的差異是由氟喹諾酮與旋轉(zhuǎn)酶-DNA復(fù)合物相互而引發(fā)，據(jù)此可以快速預(yù)測未知藥物的作用機制. Assmann等[38]發(fā)現(xiàn)萬古霉素處理糞腸球菌30 min即可觀察到細菌的拉曼光譜變化，采用偏最小二乘回歸和線性判別分析可將差異可視化，建立了基于拉曼光譜變化預(yù)測萬古霉素治療效果的數(shù)據(jù)模型，模型的準(zhǔn)確度達到90%以上，通過對抗生素- 病原體的拉曼表征，為快速的藥敏實驗鑒定提供新方法.

3.4 細菌耐藥異質(zhì)性檢測

細菌細胞的異質(zhì)性特征與抗生素的治療效果及感染機制密切相關(guān). 在感染期間，細菌群體會分化成具有不同生理特性的亞群，休眠或外排功能活躍的細菌能夠耐受抗生素的治療，具有特定增長速率的細菌會引起持續(xù)性感染. 為了提高有效治療，往往需要加大藥物濃度，使不同細菌亞群都會受到攻擊，否則，即使是小部分的“幸存者”都會導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥菌. 因此，在感染和抗生素治療期間，正確評估細菌的生理狀態(tài)顯得尤為重要. 由于細菌具有大量的突變型，利用細菌種群的平均值往往不能真實地反映實際情況，因此，在單細胞水平上檢測研究抗生素對細菌細胞的作用需要尋找新的方法并完善現(xiàn)有技術(shù)手段. 共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)能夠?qū)臉颖局兄苯臃蛛x出的致病菌進行逐個檢測，在無損的狀態(tài)下，獲得單細胞及亞細胞細微的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合拉曼成像準(zhǔn)確測量給藥過程中不同細菌細胞的異質(zhì)性變化，如藥物在細胞中的分布與動力學(xué)變化，藥物與細胞的相互作用等，為耐藥性的變遷和耐藥機制研究提供了便利的工具. Schuster等[39]在單細胞水平上用CRMS技術(shù)研究細菌種群異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)具有分子組成和生理特征不同的細菌亞群因其具有不同的拉曼光譜而容易被區(qū)分. St?ckel等[40]采用CRMS方法鑒定孢子的活力，實驗利用不同的化學(xué)和物理方法降低細菌孢子的活力，通過光譜的差異比較，發(fā)現(xiàn)一些殺菌劑僅影響細菌群落的一部分，并非所有的孢子都被滅活.

4 展望

在拉曼光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)之初，光源的選擇、儀器制造工藝和增強基底的制備都限制了拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用. 激光光源的引入大幅提升了激光功率，成為理想光源，使拉曼光譜技術(shù)和應(yīng)用得到了發(fā)展. 拉曼光譜在高濃度治療性藥物檢測和無標(biāo)記的感染病原菌監(jiān)測方面得到了飛速發(fā)展，通過收集病原體的高度特異性的分子指紋圖譜，可以區(qū)分不同菌株、得到抗生素作用的特征以及鑒定耐藥性菌株，如僅需35 min就可以從尿道感染中識別病原體，在3.5 h內(nèi)得到菌株抗生素耐藥性/敏感性的信息等[41]，拉曼光譜快速、準(zhǔn)確檢測的突出優(yōu)越性，在致病菌檢測研究中已經(jīng)占據(jù)十分重要的位置，具有廣闊前景. 拉曼光譜與顯微鏡結(jié)合后所具有的空間分辨率使其可以對單個細菌的細胞進行分析，在闡明細菌對抗菌藥物的耐藥性的分子機制方面具有巨大的應(yīng)用潛力，可跟蹤單細菌細胞的拉曼信號，有助于揭示細菌生理代謝狀態(tài)的改變，快速獲取耐藥性特征及有效預(yù)測耐藥趨勢，表征藥物- 靶標(biāo)反應(yīng)，包括藥物的吸收、外排、動力學(xué)變化以及藥物靶點(DNA/蛋白質(zhì)/細胞壁合成)的活性等，從而有效預(yù)測微生物耐藥性的發(fā)展趨勢[42]，為實現(xiàn)臨床快速診斷致病菌和制定精準(zhǔn)化的抗生素治療方案提供有力的參考依據(jù). 儀器制造工藝也正逐漸使拉曼光譜檢測設(shè)備發(fā)展得更加小巧便攜，為實現(xiàn)現(xiàn)場、快速檢測提供了巨大的發(fā)展空間. 隨著納米材料技術(shù)的發(fā)展，增強基底的功能化改良與制備成為了新的研究熱點. 目前，盡管利用拉曼技術(shù)進行細菌檢測取得了一定的研究進展，但是由于目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的細菌拉曼譜庫，不同課題組間的實驗結(jié)果尚需要相互比對驗證，這些困難的克服，將有助于推動拉曼光譜技術(shù)在臨床檢測分析上的真正實際應(yīng)用，這也是眾望所歸之處.