基于SSR標(biāo)記的野生荷花遺傳多樣性分析及指紋編碼構(gòu)建

徐君　尹江海　李欣　李軍　靖晶　王歡　姜紅衛(wèi)

摘要：為進(jìn)一步了解野生荷花資源的遺傳特征，明確荷花育種親本的遺傳背景，以蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院荷花種質(zhì)資源圃收集的15個(gè)野生荷花資源為材料，選擇17對(duì)引物，包括15對(duì)SSR引物和2對(duì)cpSSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的結(jié)果用于構(gòu)建野生荷花DNA指紋圖譜，并開展遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，15對(duì)SSR引物在15個(gè)野生荷花中共擴(kuò)增位點(diǎn)72個(gè)，平均每對(duì)引物4.8個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有72個(gè)，PPL為100%，PIC介于0.371～0.834之間;2對(duì)cpSSR引物共檢測(cè)到9個(gè)單倍型位點(diǎn)，平均每對(duì)引物4.5個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有8個(gè)，PPL為88.9%。野生荷花材料間遺傳相似系數(shù)介于0.530 9～0.925 9之間，平均值為0.676 2，采用UPGMA聚類，以系數(shù)0.669 6為依據(jù)，可將供試的15個(gè)野生荷花分為3組。

關(guān)鍵詞：野生荷花;SSR;指紋編碼;UPGMA聚類;遺傳多樣性分析

中圖分類號(hào)： S682.320.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0035-05

收稿日期：2019-12-30

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（19）3119];蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 （編號(hào)：SNG2018058）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，副研究員，主要從事水生植物分子生物學(xué)研究。E-mail：sacxujun@163.com。

通信作者：尹江海，碩士，副教授，主要從事農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理研究。E-mail：yjh721218@126.com。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo Adans.）多年生水生草本花卉，現(xiàn)存蓮屬植物有2個(gè)種，分別為亞洲蓮和美洲黃蓮。我國是亞洲蓮的原產(chǎn)地之一，北至黑龍江省富錦市，南至海南島，東至上海、臺(tái)灣等地區(qū)，西至新疆天山地區(qū)，都有荷花的分布[1]。由于荷花具有較高的觀賞、經(jīng)濟(jì)、文化和生態(tài)價(jià)值[2]，一直深受育種專家和消費(fèi)者的喜愛。從20世紀(jì)80年代開始，我國的育種專家通過引進(jìn)美洲黃蓮，并與亞洲蓮雜交，結(jié)合輻照等育種手段，創(chuàng)制了大量的荷花新品種[3]。而分布于各地原生境的野生荷花蘊(yùn)藏著豐富的優(yōu)質(zhì)性狀，是極好的荷花育種親本材料。因此搜集野生荷花資源，并對(duì)資源進(jìn)行鑒定和分類，對(duì)于進(jìn)一步利用好野生荷花資源服務(wù)于荷花育種工作有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

野生荷花一般為原始的單瓣品種，僅僅通過形態(tài)學(xué)很難完全區(qū)分，且形態(tài)學(xué)鑒定具花費(fèi)周期較長、結(jié)果易受人為因素干擾等缺點(diǎn)[4]。相對(duì)于形態(tài)學(xué)鑒定，分子標(biāo)記鑒定是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的方法。目前，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）[5]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）[6]、簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）[7]等分子標(biāo)記都有被應(yīng)用于荷花親緣關(guān)系分析的報(bào)道。此外，薛建華等采用開發(fā)的簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記，建立了荷花品種DNA指紋圖譜構(gòu)建方法[8]。雖然分子標(biāo)記在荷花資源分類中已有較多應(yīng)用，但現(xiàn)有報(bào)道多見于栽培品種，對(duì)野生荷花的系統(tǒng)研究幾乎沒有。本研究擬采用文獻(xiàn)報(bào)道多態(tài)性較好的SSR引物，對(duì)供試的15個(gè)野生荷花進(jìn)行SSR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增位點(diǎn)信息構(gòu)建指紋編碼，并對(duì)這些材料進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析，旨在能夠從分子水平對(duì)野生荷花材料進(jìn)行分類和鑒定，為野生荷花親緣關(guān)系研究及分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的15個(gè)野生荷花材料（表1）采集于各地原生境，保存于蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院荷花資源保存圃，采用盆栽方式栽培保存。于2018年清明節(jié)前后對(duì)所有材料進(jìn)行翻盤并采用健康的種藕繁殖，同年4月采集植株嫩葉，取樣時(shí)采用0.5 cm打孔器，在葉片四周、中部各打1孔，每個(gè)材料取3張葉片，樣本洗凈后直接放入離心管用液氮處理，置于-20 ℃凍存。

1.2 DNA的提取與驗(yàn)證

全基因組DNA提取采用經(jīng)典十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[9]，提取的DNA樣本采用120 V電壓1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。并用Nano drop 2000對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，將所提DNA濃度稀釋至20 ng/μL，置于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 荷花SSR標(biāo)記

參考Yang等基于我國古代蓮全基因組開發(fā)的核微衛(wèi)星（nSSR）引物[10]，選擇12對(duì)（SSR016、SSR030、SSR040、SSR045、SSR049、SSR064、SSR067、SSR074、SSR088、SSR285、SSR472和SSR482）;參考Tian等篩選的SSR引物[11]，選擇2對(duì)（Nelumbo13和Nelumbo14）;參考Kubo等篩選的SSR引物[12]，選擇1對(duì)（ns034）;參考Xue等從蓮葉綠體全基因組中開發(fā)的單倍標(biāo)記葉綠體基因組微衛(wèi)星標(biāo)記（cpSSR）引物[13]，篩選2對(duì)（Lotus12和Lotus17）。一共有15對(duì)SSR引物和 2對(duì)cpSSR引物（序列信息詳見表2）用于野生荷花指紋編碼構(gòu)建及親緣關(guān)系鑒定。正向引物5′端用4種熒光修飾[羧基熒光素（FAM）、六氯-6-甲基熒光素（HEX）、羧基-X-羅丹明（ROX）和羧基四甲基羅丹明（TAMRA）]，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)試劑采用TOYOBO公司的KOD-Plus試劑盒。PCR反應(yīng)體系：10×KOD buffer? 2.5 μL;2 mmol/L dNTPs? 2 μL;25 mmol/L MgSO4 05 μL;10 μmol/L Forward Primer? 1 μL;10 μmol/L Reverse Primer? 1 μL;Template DNA? 1 μL;KOD-Plus 1 U;補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，適宜退火溫度（各引物的退火溫度見表2）30 s，72 ℃ 30 s 共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后產(chǎn)物置于 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光引物擴(kuò)增后產(chǎn)物利用ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果采用GeneMarker進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，內(nèi)參大小依次為5111、75.71、100.73、139.81、149.80、160.75、20081、250.78、300.79、340.78、350.78、400.80、450.78、490.82、500.90 bp。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)各引物擴(kuò)增得到的擴(kuò)增峰數(shù)量，采用人工讀取的方法，對(duì)照內(nèi)參在相同遷移位置上，有峰的計(jì)為1，無峰的計(jì)為0，每個(gè)峰相當(dāng)于1個(gè)等位基因位點(diǎn)。使用Excel軟件建立供試野生荷花材料與等位基因位點(diǎn)之間的0/1矩陣圖，統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增出的總位點(diǎn)數(shù)（T）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（N），記錄每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增片段的長度及每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）。PPL計(jì)算公式：PPL=（N/T）×100% 。利用Cervus 3.0.7軟件計(jì)算15對(duì)SSR引物的多態(tài)性信息含量（PIC）;利用NTSYS 2.0.1軟件計(jì)算供試材料間的遺傳相似性，構(gòu)建UPGMA聚類圖。將15個(gè)荷花材料通過不同引物擴(kuò)增獲得的等位基因位點(diǎn)，按照擴(kuò)增片段長度從小到大的順序依次用阿拉伯?dāng)?shù)字編碼，位點(diǎn)超過9個(gè)以上，用個(gè)位數(shù)帶下劃線表示，構(gòu)建野生荷花指紋編碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選的17對(duì)引物，對(duì)15個(gè)野生荷花樣本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、PIC見表3。15對(duì)SSR引物在15個(gè)野生荷花中共擴(kuò)增位點(diǎn)72個(gè)，平均每對(duì)引物4.8個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有72個(gè)，PPL為100%。15對(duì)SSR引物擴(kuò)增15個(gè)野生荷花的PIC介于0371～0.834之間，平均值為0.605，其中12對(duì)SSR引物的PIC大于0.5，說明15個(gè)野生荷花材料具備一定的多態(tài)性。2對(duì)cpSSR引物共檢測(cè)到9個(gè)單倍型位點(diǎn)，平均每對(duì)引物4.5個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)8個(gè)，PPL為88.9%。引物擴(kuò)增位點(diǎn)片段的長度有較大差異。SSR引物中，ns034擴(kuò)增的片段最短，為 102～124 bp，引物SSR088擴(kuò)增的片段較長，為285～301 bp。此外，cpSSR引物中Lotus12擴(kuò)增的片段最長，為380～434 bp。

2.2 15個(gè)野生荷花材料的遺傳差異分析

根據(jù)SSR標(biāo)記位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算15個(gè)野生荷花材料之間的遺傳相似系數(shù)（表4），發(fā)現(xiàn)15個(gè)材料兩兩間的遺傳相似系數(shù)為0.530 9～0.925 9，相似系數(shù)平均值為0.676 2，遺傳相似系數(shù)越大說明材料間的遺傳差異越小。南埂野生蓮和汶溪紅蓮的遺傳相似系數(shù)最小，為0.530 9，說明二者遺傳差異較大。同樣采集于云南文山普者黑地區(qū)的野生荷花普者黑紅荷和普者黑白荷之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.947 4，二者遺傳差異最小。對(duì)表4中15個(gè)野生荷花材料兩兩間共105個(gè)相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖1所示，以遺傳相似系數(shù) 0.669 6 為依據(jù)，可將15個(gè)材料分為3個(gè)組，其中Ⅰ組有2個(gè)野生荷花材料，分別為南埂野生蓮和蓮湖野生蓮;Ⅱ組有6個(gè)野生荷花材料，分別為山廟前野生蓮、微山湖紅蓮、東湖紅蓮、白洋淀紅蓮、西湖紅蓮、太湖紅蓮;Ⅲ組有7個(gè)野生荷花材料，分別為清塘野生蓮、洞庭湖野生蓮、汶溪紅蓮、濟(jì)寧野生紅蓮、普者黑白荷、普者黑紅荷、蘇州青蓮子。由此可見，同省份的荷花并未完全分在一組。

2.3 野生荷花指紋編碼的構(gòu)建

15對(duì)SSR二倍體標(biāo)記共有30位數(shù)字，2對(duì)cpSSR標(biāo)記共有2位數(shù)字，因此本試驗(yàn)使用的17對(duì)引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)每個(gè)野生荷花材料的DNA編碼由32位數(shù)字組成。將每對(duì)引物對(duì)15個(gè)野生荷花材料擴(kuò)增獲得的所有位點(diǎn)按照片段大小從小到大進(jìn)行編碼，建立編碼標(biāo)準(zhǔn)如表5所示。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)15個(gè)野生荷花的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，構(gòu)建15個(gè)野生荷花材料的指紋編碼（表6），結(jié)果顯示該方法可以將15個(gè)野生荷花材料完全區(qū)分開。

3 討論與結(jié)論

荷花是我國重要的經(jīng)濟(jì)和觀賞作物， 在景觀布置、水環(huán)境治理等方面也有較多的應(yīng)用。從遺傳多樣性角度而言，荷花的遺傳背景相對(duì)狹窄，要利用好荷花滿足不同的產(chǎn)業(yè)需求，必須充分發(fā)掘現(xiàn)有的荷花資源。野生荷花多為單瓣型[14]，與栽培荷花相比，性狀相似，觀賞性不足，但野生荷花中包含有很多特殊性狀，如有學(xué)者在云南普者黑地區(qū)發(fā)現(xiàn)的株型超過3米的野生荷花，為大株型荷花新品種選育提供了非常好的親本材料[15]。因此，做好野生荷花鑒定工作，對(duì)引導(dǎo)荷花育種，尤其是特色荷花育種，全面開發(fā)荷花資源具有重要的意義。

要單獨(dú)采用表型鑒定的方法區(qū)分野生荷花材料相對(duì)較困難，有報(bào)道顯示，SSR標(biāo)記是一種有效、可靠的分子標(biāo)記，可用于荷花親緣關(guān)系鑒定和指紋圖譜的構(gòu)建[8]。本研究采用前期研究所篩選的17對(duì)引物，包括15對(duì)SSR引物和2對(duì)cpSSR引物，對(duì)來源不同的15個(gè)野生荷花材料基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)15對(duì)SSR引物可擴(kuò)增位點(diǎn)72個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有72個(gè)，PPL為100%;2對(duì)cpSSR引物可擴(kuò)增位點(diǎn)9個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有8個(gè)，PPL為889%。不同來源的野生荷花雖然表型性狀相似，但擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性比例高，說明其中具有豐富的基因多樣性可以被挖掘。UPGMA分析結(jié)果顯示，15個(gè)野生荷花材料互相之間遺傳相似系數(shù)平均值為0.676 2，說明部分供試的野生荷花材料之間的相似度還是比較高的，其來源可能比較接近。盡管如此，通過SSR標(biāo)記可以有效地區(qū)分15個(gè)野生荷花，每種荷花均有其特殊的指紋編碼，這為進(jìn)一步明確野生荷花親緣關(guān)系，將其用于荷花育種提供了基礎(chǔ)。

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