Eplet匹配對(duì)腎移植術(shù)后供者特異性抗體產(chǎn)生及急性排斥反應(yīng)發(fā)生的影響

匡培丹，張璇，張穎，丁小明，薛武軍，雷艷君，鄭瑾

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安710061

腎移植是終末期腎病的一種有效治療手段，但腎移植術(shù)后供者特異性抗體(DSA)產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生可導(dǎo)致移植腎失功能。因此，移植腎長(zhǎng)期存活仍然是目前移植領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題之一[1-2]。組織配型技術(shù)的快速發(fā)展，使器官移植供受者選擇達(dá)到了更為精準(zhǔn)的層面。近年來(lái)，在腎移植領(lǐng)域涌現(xiàn)出了大量關(guān)于人類白細(xì)胞抗原(HLA)功能性表位(Eplet)的報(bào)道[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，HLA匹配程度與腎移植長(zhǎng)期存活密切相關(guān)[5]。良好的HLA匹配，不僅可減少腎移植患者免疫抑制劑應(yīng)用劑量，還可降低患者致敏程度[6]。目前，臨床器官移植主要的HLA匹配方式有HLA抗原匹配、氨基酸殘基(Res M)匹配和HLA Matchmaker匹配。HLA抗原匹配和Res M匹配僅需要HLA血清學(xué)分型結(jié)果，方法相對(duì)簡(jiǎn)單，易操作。然而，就單個(gè)移植中心而言，由于供受者樣本池太小，獲得良好供受者HLA抗原匹配的概率非常低。Res M匹配基于交叉反應(yīng)組[7]，能夠提高供受者良好的匹配概率，但對(duì)于致敏受者預(yù)存的供者DSA無(wú)法有效避開(kāi)。HLA Matchmaker匹配基于HLA抗原氨基酸序列上的Eplet，需要分析供受者HLA基因分型，方法較為復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。Eplet匹配將HLA抗原描述為一系列抗體靶點(diǎn)或表位，相對(duì)于HLA抗原匹配或Res M匹配，能夠提供一個(gè)更結(jié)合臨床實(shí)際的HLA匹配系統(tǒng)，從而降低了移植后致敏的風(fēng)險(xiǎn)，避免了移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生[8]。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于腎移植Eplet匹配的研究報(bào)道較少。本研究探討了Eplet匹配對(duì)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生及急性排斥反應(yīng)發(fā)生的影響，旨在揭示Eplet匹配在腎移植組織配型中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年6月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)施腎移植術(shù)患者787例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次接受腎移植術(shù)；②年齡18～65歲；③術(shù)前群體反應(yīng)性抗體(PRA)陰性；④術(shù)后接受免疫抑制劑治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性感染性疾病者；②合并心、肝、肺等重要臟器嚴(yán)重疾病者；③合并惡性腫瘤者；④術(shù)后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)者；⑤治療依從性差者。根據(jù)供者來(lái)源分為公民逝世后捐獻(xiàn)即死亡捐獻(xiàn)(DD)632例和親屬活體捐獻(xiàn)(LRD)155例。DD受者男455例、女177例，年齡(36.05±9.01)歲，BMI(20.40±2.95)kg/m2，透析齡(13.01±7.20)個(gè)月，原發(fā)?。郝阅I炎362例、IgA腎病91例、膜性腎病81例、高血壓腎病67例、其他31例；LRD受者男127例、女28例，年齡(26.13±6.01)歲，BMI(21.60±1.97)kg/m2，透析齡(9.13±3.51)個(gè)月，原發(fā)病：慢性腎炎92例、IgA腎病21例、膜性腎病18例、高血壓腎病16例、其他8例。DD供者男508例、女124例，年齡(44.98±11.36)歲，BMI(21.80±2.43)kg/m2，原發(fā)?。耗X外傷296例、腦出血294例、腦膠質(zhì)瘤24例、其他18例；器官獲取前血清Scr(107.86±80.34)μmol/L，熱缺血時(shí)間(4.58±1.67)min，冷缺血時(shí)間(8.74±3.58)h；LRD供者男76例、女79例，年齡(46.45±4.36)歲，BMI(22.7±3.05)kg/m2，器官獲取前血清Scr(69.38±10.52)μmol/L，熱缺血時(shí)間(2.13±0.57)min，冷缺血時(shí)間(1.14±0.34)h。DD受者與LRD受者年齡、透析齡比較P均<0.05，其余臨床資料比較P均>0.05；DD供者與LRD供者性別、血清Scr水平、熱缺血時(shí)間、冷缺血時(shí)間比較P均<0.05，年齡、BMI比較P均>0.05。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院人體器官移植臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 研究方法 腎移植前采用LABType SSO HD試劑盒對(duì)供受者HLA Ⅰ類(A、B、C位點(diǎn))和Ⅱ類(DR、DQ位點(diǎn))抗原進(jìn)行高分辨分型，采用LABType SSO試劑盒進(jìn)行中分辨分型，經(jīng)Fusion軟件分析獲取供受者HLA抗原基因分型和血清學(xué)分型信息。

供受者在腎移植手術(shù)前進(jìn)行HLA抗原匹配和Res M匹配。HLA抗原匹配根據(jù)供受者實(shí)際HLA抗原血清學(xué)分型的位點(diǎn)進(jìn)行人工對(duì)比匹配，供受者HLA抗原位點(diǎn)完全相同視為匹配，否則視為不匹配；Res M匹配根據(jù)供受者HLA抗原血清學(xué)分型位點(diǎn)所在的CREA進(jìn)行匹配[7]，如供受者HLA抗原在同一CREA視為匹配，否則視為不匹配。Eplet匹配根據(jù)供受者HLA抗原基因分型位點(diǎn)，采用HLA Matchmaker軟件(Version 2.1，available from: www.hlamatchmaker.net)進(jìn)行供受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)分析，如供受者HLA抗原氨基酸序列上的Eplet相同視為匹配，否則視為不匹配。

1.3 腎移植術(shù)后免疫抑制治療與隨訪 腎移植手術(shù)期間和腎移植術(shù)后1～4 d予抗人胸腺細(xì)胞球蛋白50 mg/d、甲基強(qiáng)的松龍250 mg/d誘導(dǎo)治療。腎移植術(shù)后接受三聯(lián)免疫抑制方案治療：他克莫司0.1 mg/(kg·d)或環(huán)孢霉素4.5～5.0 mg/(kg·d)，甲基強(qiáng)的松龍10～20 mg/d；腎移植術(shù)后第1天嗎替麥考酚酯1.5～2.0 g/d。環(huán)孢霉素或他克莫司與甲基強(qiáng)的松龍?jiān)谡T導(dǎo)治療最后1 d同步給藥。

腎移植術(shù)后門診定期隨訪，分別于第4、12、26、52周，留取血清樣本，采用LABScreen Mix試劑盒檢測(cè)PRA。如果PRA陽(yáng)性，采用LABScreen Single Antigen試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)HLA Ⅰ、Ⅱ類DSA，并評(píng)估樣品中每個(gè)微珠的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。MFI峰值≥1 000為陽(yáng)性。

1.4 急性排斥反應(yīng)判斷 急性排斥反應(yīng)的臨床診斷根據(jù)《腎移植排斥反應(yīng)臨床診療技術(shù)規(guī)范(2019版)》[9]。移植腎組織抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(AMR)、細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(TCMR)、AMR+TCMR病理診斷依據(jù)《Banff-2017移植腎病理分類方案》。

2 結(jié)果

2.1 供受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與HLA Res M匹配、HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)的關(guān)系 供受者HLA A、B、C、DR、DQ位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)為62.18±21.62，HLA A、B、DR位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)為50.59±17.00。供受者HLA A、B、DR位點(diǎn)Res M匹配錯(cuò)配數(shù)為1.84±1.00，A、B、C、DR、DQ位點(diǎn)HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)為8.05±1.58。Pearson相關(guān)分析顯示，供受者HLA A、B、DR位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與Res M匹配錯(cuò)配數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.226，P<0.01)，供受者HLA A、B、C、DR、DQ位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.475，P<0.01)。

2.2 LRD與DD供受者HLA匹配效果比較 LRD與DD供受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)分別為43.94±19.86、66.65±19.60，二者比較P<0.01。見(jiàn)表1。

表1 LRD與DD供受者HLA匹配效果比較

2.3 LRD與DD移植術(shù)后HLA抗體產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生情況比較 LRD受者腎移植術(shù)后PRA陽(yáng)性率為5.16%(8/155)、DSA陽(yáng)性率為1.29%(2/155)，DD受者腎移植術(shù)后PRA陽(yáng)性率為12.50%(79/632)、DSA陽(yáng)性率為3.48%(22/632)，LRD受者腎移植術(shù)后PRA、DSA陽(yáng)性率均低于DD受者(P均<0.01)。LRD受者腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率為3.23%(5/155)，DD受者腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率為9.65%(61/632)，DD受者腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率高于LDR受者(P<0.01)。

2.4 Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與腎移植術(shù)后HLA抗體產(chǎn)生的關(guān)系 PRA陽(yáng)性與陰性受者Res M匹配錯(cuò)配數(shù)分別為2.11±1.13、1.80±0.41，二者比較P<0.05；DSA陽(yáng)性與陰性受者Res M匹配錯(cuò)配數(shù)分別為2.08±1.14、1.81±0.45，二者比較P<0.05。PRA陽(yáng)性與陰性受者HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)分別為8.04±1.73、8.05±1.82，二者比較P>0.05；DSA陽(yáng)性與陰性受者HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)分別為8.09±1.09、8.03±1.54，二者比較P>0.05。PRA陽(yáng)性與陰性受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)分別為72.12±21.73、61.08±21.34，二者比較P<0.05；DSA陽(yáng)性與陰性受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)分別為73.00±20.42、61.97±21.59，二者比較P<0.05。

2.5 Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)系 787例接受腎移植患者術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率為8.39%(66/787)，其中AMR為3.05%(24/787)、TCMR為3.94%(31/787)、AMR+TCMR為1.40%(11/787)。急性排斥反應(yīng)陽(yáng)性與陰性受者Res M匹配錯(cuò)配數(shù)分別為1.87±0.82、1.84±1.01，HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)分別為8.36±1.19、8.04±1.59，二者比較P均>0.05。急性排斥反應(yīng)陽(yáng)性與陰性受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)分別為72.17±21.04、61.58±21.48，二者比較P<0.05。

2.6 Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)對(duì)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生的預(yù)測(cè)效能 HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)為0.673(95%CI：0.527～0.775，P<0.05)，其截?cái)?cut off)值為8.50，此時(shí)其預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的敏感度為71%、特異度為55%；Res M匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的AUC為0.613(95%CI：0.505～0.720，P>0.05)；Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的AUC為0.719(95%CI：0.621～0.817，P<0.05)，其cut off值為78.59，此時(shí)其預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的敏感度為71%、特異度為79%。

HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的AUC為0.612(95%CI：0.522～0.701，P<0.05)，其cut off值為8.50，此時(shí)其預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的敏感度為68%、特異度為57%；Res M匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的AUC為0.502(95%CI：0.414～0.590，P>0.05)；Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的AUC為0.737(95%CI：0.646～0.828，P<0.05)，其cut off值為75.43，此時(shí)其預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生的敏感度為70%、特異度為78%。

3 討論

腎移植是目前終末期腎病最佳的替代治療方法，但腎移植術(shù)后受者DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生可導(dǎo)致移植腎失功能。目前認(rèn)為，DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生的原因包括HLA不完全匹配、免疫抑制劑治療劑量不足、移植腎功能延遲恢復(fù)等，其中HLA不完全匹配是DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生的直接原因。

HLA是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要組織相容性抗原。以往研究認(rèn)為，HLA Ⅰ類抗原不匹配是LRD腎移植臨床效果不佳的預(yù)測(cè)因子，但在DD腎移植中并不重要[5]。隨著HLA DR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，HLA抗原不匹配對(duì)DD腎移植的影響得到了證實(shí)[10]。即使是在鈣調(diào)神經(jīng)抑制劑的免疫抑制療法時(shí)代，HLA A、B、DR位點(diǎn)匹配情況與移植物存活率仍存在明顯的線性關(guān)系[11]。體液免疫被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性同種異體移植物丟失的最主要原因[12]。HLA抗原不匹配是新生HLA特異性抗體產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素，同時(shí)又與較差的移植物存活率及移植術(shù)后致敏作用增強(qiáng)密切相關(guān)[13]。因此，良好的供受者HLA匹配是組織器官移植的基礎(chǔ)。1987年美國(guó)器官分配聯(lián)合網(wǎng)制定了強(qiáng)制性HLA六抗原匹配腎臟分享政策，要求ABO血型相容和HLA六個(gè)抗原相配的腎臟在全國(guó)范圍內(nèi)共享。按零抗原錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)選擇供受者的腎移植能夠獲得較為理想的1、5、10、20年腎存活率，但能夠達(dá)到六抗原相配的腎移植僅占2%～5%。由于我國(guó)各移植中心供受者的樣本池太小，能夠達(dá)到零抗原錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)的腎移植比例更低。因此，HLA抗原錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)用性受到很大限制。1996年，TAKEMOTO研究團(tuán)隊(duì)對(duì)近4萬(wàn)例尸體腎移植進(jìn)行隨訪分析，提出了一種新的配型策略——Res M匹配，又稱交叉反應(yīng)組配型[7]。目前，我國(guó)多數(shù)器官移植中心認(rèn)同HLA Ⅰ、Ⅱ類Res M配型標(biāo)準(zhǔn)[14]。但由于Res M配型標(biāo)準(zhǔn)基于HLA抗原血清學(xué)分型交叉反應(yīng)組，對(duì)致敏受者體內(nèi)預(yù)存的DSA無(wú)法有效避開(kāi)。

抗原表位是結(jié)合DSA所需的最小結(jié)構(gòu)決定因素?？贵w的抗原結(jié)合位點(diǎn)是由輕鏈和重鏈的可變區(qū)域配對(duì)形成的。近年研究發(fā)現(xiàn)，抗原抗體結(jié)合的特異性主要是由2～5個(gè)氨基酸組成的集群決定，稱之為Eplet[15]。DUQUESNOY團(tuán)隊(duì)基于HLA Matchmaker軟件(www.epitopes.net)分析供者所含有的非受者自身Eplet個(gè)數(shù)發(fā)現(xiàn)，Eplet個(gè)數(shù)能夠預(yù)測(cè)移植術(shù)后DSA產(chǎn)生的概率，并且其預(yù)測(cè)DSA產(chǎn)生概率的準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)和Res M匹配錯(cuò)配數(shù)[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，供受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與傳統(tǒng)組織配型方法HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)、Res M匹配錯(cuò)配數(shù)均密切相關(guān)；LRD供受者各位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)均低于DD供受者各位點(diǎn)Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)，與LIM等[8]報(bào)道基本一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后PRA、DSA陽(yáng)性受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)均高于其陰性受者；同樣，腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)高于未發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者。雖然Res M匹配錯(cuò)配數(shù)在腎移植術(shù)后PRA、DSA陽(yáng)性受者與PRA、DSA陰性受者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是其在發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者與未發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)在腎移植術(shù)后PRA陽(yáng)性與陰性、DSA陽(yáng)性與陰性以及發(fā)生與未發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在相同條件下，基于Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)的分析結(jié)果卻能與DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生有關(guān)，并且Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)對(duì)腎移植術(shù)后DSA產(chǎn)生及急性排斥反應(yīng)發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯優(yōu)于HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)和Res M匹配錯(cuò)配數(shù)。結(jié)果表明Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)、Res M匹配錯(cuò)配數(shù)具有一定關(guān)系，并且較傳統(tǒng)組織配型方法更靈敏。但Eplet匹配的臨床應(yīng)用還有一些問(wèn)題亟待解決。首先，高分辨率的HLA分型是確定HLA抗原表位的必要條件。其次，需要一個(gè)能定義完整Eplet表位的健全系統(tǒng)。雖然DUQUESNOY團(tuán)隊(duì)的Eplet是最佳的候選產(chǎn)品，但所有Eplet的生物學(xué)相關(guān)性和相對(duì)免疫原性還有待進(jìn)一步確定。

綜上所述，供受者Eplet匹配錯(cuò)配數(shù)與HLA抗原匹配錯(cuò)配數(shù)和Res M匹配錯(cuò)配數(shù)密切相關(guān)，并可影響腎移植受者術(shù)后DSA產(chǎn)生和急性排斥反應(yīng)發(fā)生。Eplet匹配較傳統(tǒng)組織配型方法更靈敏，具有更廣泛的臨床應(yīng)用前景。