基于JAK-STAT+SOCS負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)通路探討眩暈方對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制研究

蔣 錦，陸培春，劉 琴，徐 靜

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

頸椎?。╟ervical spondylosis）是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，導(dǎo)致脊柱內(nèi)外組織結(jié)構(gòu)平衡失調(diào)并刺激或壓迫周圍組織結(jié)構(gòu)（血管、神經(jīng)根、交感神經(jīng)和脊髓），進(jìn)而誘發(fā)一系列癥狀，如頭痛、肩背疼痛、麻木、無(wú)力感等。其多歸因于頸椎間盤退變、頸椎骨質(zhì)增生以及頸部外傷勞損或先天骨發(fā)育異常。頸椎病近年來(lái)發(fā)病率逐年升高，預(yù)防和治療頸椎病已成為全球共同關(guān)注和解決的問(wèn)題之一。神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylotic radiculopathy，CSR）是頸椎病的常見(jiàn)表型[1，2]；神經(jīng)根性疼痛是CSR患者的典型癥狀[3]。CSR的發(fā)病可歸因于頸椎間盤突出、椎后小關(guān)節(jié)增生退變壓迫背根神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)根[4，5]。

JAK是一類胞質(zhì)內(nèi)非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶。該家族四大成員中的JAK1、JAK2和TYK2廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，而另一成員JAK3僅存在于骨髓和淋巴系統(tǒng)[6]。此外，STAT是一種能夠結(jié)合于DNA的獨(dú)特蛋白家族，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[7]。JAK/STAT負(fù)調(diào)節(jié)主要涉及以下三個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子:細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白（suppressors of cytokine signaling，SOCS）、活化STATs蛋白抑制因子、蛋白酪氨酸磷酸酶[8]。其中SOCS家族是1997年以來(lái)發(fā)現(xiàn)的JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)調(diào)控因子，其成員包括CIS和SOCS1-7。SOCS1和SOCS3是SOCS家族中的重要成員，是先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答關(guān)鍵性生理調(diào)節(jié)因子，參與廣泛的生物學(xué)過(guò)程。此外，二者也是JAK激酶和STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要抑制因子[9]，通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)阻止細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及凋亡抑制。研究[10]發(fā)現(xiàn)，SOCS3與STAT3在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。

此外，眩暈方是基于半夏白術(shù)天麻湯加減的經(jīng)驗(yàn)方[11]，包括藥物當(dāng)歸、川芎、丹參、葛根、白芍、熟地、白術(shù)、茯苓、澤瀉、菖蒲、磁石、桂枝。該自擬方在活血通絡(luò)、改善微循環(huán)缺血、除煩安神、中樞鎮(zhèn)驚鎮(zhèn)疼、抑制急性炎癥水腫等方面作用顯著。鑒于此，本研究基于JAK-STAT/SOCS負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)通路探討眩暈方對(duì)CSR大鼠鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司的Sprague-Dawley健康雄性大鼠（66只，6周齡，體重160～200 g），飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境，使用人工照明，每天白天12 h，夜間12 h（08:00～20:00），允許自由飲水及進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將66只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（正常對(duì)照）、模型組（CSR大鼠模型構(gòu)建）、治療組（我院自擬眩暈方藥物治療），每組22只。

1.2 實(shí)驗(yàn)造模

腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠。俯臥位固定，常規(guī)消毒后，手觸下頸部附近最高棘突（T2），以第2胸椎棘突為標(biāo)記，以頸7為中心，沿棘突縱行切開(kāi)皮膚及皮下組織、頸后部肌群，直至C6～T2椎弓充分暴露，暴露棘突及兩側(cè)椎板，用眼科剪刀剪斷頸6-7兩側(cè)橫突以上椎板，暴露出椎管內(nèi)脊髓，顯露出左側(cè)頸6、7神經(jīng)根，使用尼龍漁線（約1.5cm長(zhǎng)，直徑0.5mm）誘導(dǎo)頸神經(jīng)根炎癥，建立CSR模型。術(shù)后常規(guī)慶大霉素注射，連續(xù)3天。假手術(shù)組動(dòng)物僅鉗開(kāi)C7椎板，暴露脊髓，無(wú)插線處理。手術(shù)完成后，待動(dòng)物于SPF恒溫房?jī)?nèi)蘇醒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠干預(yù)方法假手術(shù)組:正常飲食和飲水，無(wú)任何干預(yù)處置。造模后第3天開(kāi)始干預(yù)，模型組每日抓取1次，無(wú)藥物干預(yù)處置；治療組予以我院自擬眩暈方，藥物如下:當(dāng)歸15g、川芎12g、丹參15g、葛根12g、白芍15g、熟地15g、白術(shù)15g、茯苓12g、澤瀉18g、菖蒲9g、磁石15g、桂枝6g。水煎至200mL，分為兩袋，早晚餐后半小時(shí)各1袋。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為和體征觀察CSR大鼠模型建立后，觀察行為學(xué)變化，如大鼠的精神狀態(tài)、體重變化、活動(dòng)度、關(guān)節(jié)腫脹度、毛色毛質(zhì)、死亡情況等。

1.3.3 機(jī)械痛閾測(cè)定和步態(tài)評(píng)估干預(yù)7天后，采用YLS-3E型痛分析儀對(duì)各組大鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)定。同時(shí)，觀察大鼠行走及休息時(shí)的步態(tài)，參照Kawakami等法對(duì)大鼠疼痛所致步態(tài)障礙進(jìn)行評(píng)估，采用計(jì)分制（1分=正常步態(tài)、足無(wú)畸形；2分=正常步態(tài)，伴足內(nèi)收蜷縮畸形；3分=輕度步態(tài)障礙；4分=嚴(yán)重步態(tài)障礙）。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組大鼠IL-6、PGE2含量干預(yù)7天后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠致死，取壓線處脊髓及神經(jīng)根組織，制成組織勻漿。按ELISA試劑盒操作方法，采用ELISA法分別檢測(cè)IL-6、PGE2含量。反應(yīng)結(jié)束后30min內(nèi)，采用酶標(biāo)儀在450nm處讀取OD值。

1.3.4 免疫共沉淀法檢測(cè)SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用如上述操作，取組織制成組織勻漿。離心后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上賦予后低溫離心10min；取上清液，加入SOCS與JAK1、SOCS3與STAT3抗體，4℃孵育過(guò)夜。免疫共沉淀法檢測(cè)SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究基于SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc，Chicago，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)表示形式，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動(dòng)物行為和體征觀察

假手術(shù)組大鼠精神良好，進(jìn)食良，喜動(dòng)，活動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，皮毛光亮，舌質(zhì)淡紅，尾色正常，足爪未見(jiàn)腫脹，體重增長(zhǎng)平穩(wěn)。造模后觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠進(jìn)食明顯減少，活動(dòng)量減低，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)暗淡無(wú)光，雙后足腫脹、潰爛，走路微跛，觸碰時(shí)躲避并嘶叫伴弓背蜷縮，體重增加不顯著。而治療組大鼠毛色光澤及進(jìn)食量均較前改善，活動(dòng)量增加，雙后足腫脹潰爛及跛行癥狀減輕，體重增長(zhǎng)恢復(fù)平穩(wěn)。

2.2 各組大鼠機(jī)械痛閾測(cè)定

組間檢驗(yàn)結(jié)果提示:相比假手術(shù)組，模型組大鼠機(jī)械痛閾下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而相比模型組，治療組大鼠機(jī)械痛閾升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 各組大鼠機(jī)械痛閾測(cè)定對(duì)比

2.3 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較

組間檢驗(yàn)結(jié)果提示:相比假手術(shù)組，模型組大鼠步態(tài)評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而相比模型組，治療組大鼠步態(tài)評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 各組大鼠步態(tài)評(píng)分對(duì)比

2.4 ELISA法檢測(cè)各組大鼠IL-6、PGE2含量

與假手術(shù)組相比:模型組IL-6和PGE2水平均顯著提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而相比模型組，治療組IL-6和PGE2水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 各組大鼠IL-6、PGE2含量對(duì)比

2.5 免疫共沉淀法檢測(cè)SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用

SOCS1和STAT3抗體的免疫沉淀細(xì)胞裂解液中條帶與input陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞液中的條帶一致，存在JAK1；而陰性對(duì)照液細(xì)胞裂解液中未出現(xiàn)特異性條帶，不存在JAK1和SOCS3；提示JAK1和SOCS3的成功表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)SOCS1抗體沉淀的細(xì)胞裂解液中含有JAK1，STAT3抗體沉淀的細(xì)胞裂解液中含有SOCS3，因此SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3存在結(jié)合。

3 討論

本研究之初已發(fā)現(xiàn)炎癥因子的介導(dǎo)在CSR急性期根性疼的發(fā)生、發(fā)展和緩解中有重要意義[12]。采用頸椎插線法構(gòu)建CSR大鼠模型，可準(zhǔn)確反映頸神經(jīng)根炎癥反應(yīng)的變化過(guò)程，且方法簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，實(shí)驗(yàn)周期短，可重復(fù)性好。此外，眩暈方是基于半夏白術(shù)天麻湯加減的經(jīng)驗(yàn)方，具有行氣活血通絡(luò)功效。該項(xiàng)研究從JAK-STAT/SOCS負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)通路的新思路出發(fā)，構(gòu)建大鼠CSR模型，重點(diǎn)脊髓組織中SOCS1-JAK1、SOCS3-STAT3蛋白相互作用的檢測(cè)，探討眩暈方對(duì)CSR的治療意義，以期提出新型治療理論以指導(dǎo)眩暈方的臨床應(yīng)用，為闡明眩暈方對(duì)大鼠鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制提供臨床循證依據(jù)。

本研究將66只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，用隨機(jī)數(shù)字表法抽取22只分為假手術(shù)組、造模組、治療組。各組大鼠動(dòng)物行為和體征觀察結(jié)果顯示，相比假手術(shù)組大鼠行為和體征表現(xiàn)正常，造模后大鼠進(jìn)食明顯減少，活動(dòng)量減低，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)暗淡無(wú)光，雙后足腫脹、潰爛；而治療組大鼠毛色、進(jìn)食量、活動(dòng)量、雙后足腫脹、和體重均明顯恢復(fù)，初步提示眩暈方在改善CSR大鼠癥狀的作用。隨后本研究進(jìn)一步評(píng)估并對(duì)比各組大鼠機(jī)械痛閾和步態(tài)評(píng)分結(jié)果，提示相較假手術(shù)組，模型組大鼠機(jī)械痛閾下降、步態(tài)評(píng)分升高，而治療組大鼠機(jī)械痛閾升高、步態(tài)評(píng)分降低。為明晰其作用機(jī)制，本研究采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠IL-6、PGE2含量。ELISA具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。其測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原，故在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)IL-6、PGE2具有可行性。結(jié)果提示與假手術(shù)組相比，模型組呈上升趨勢(shì)，而與模型組相比，治療組前述指標(biāo)呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，免疫共沉淀是確定兩蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)SOCS1-JAK1和SOCS3-STAT3蛋白相互作用可采用此方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS1抗體沉淀的細(xì)胞裂解液中含有JAK1，STAT3抗體沉淀的細(xì)胞裂解液中含有SOCS3，提示SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3存在結(jié)合。

就其機(jī)制而言，JAK-STAT信號(hào)通路在發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的同時(shí)，可發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能，調(diào)控通路平衡[13]。SOCS是JAK/STAT的負(fù)調(diào)節(jié)的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。本院自擬眩暈方中川芎行氣活血通絡(luò)[14]；葛根有退熱、升陽(yáng)、生津作用；當(dāng)歸補(bǔ)血活血通絡(luò)[15]；丹參養(yǎng)血活血通絡(luò)，除煩安神，并鎮(zhèn)驚鎮(zhèn)疼；白芍養(yǎng)血斂陰，平抑肝陽(yáng)。白術(shù)、云苓、澤瀉相配，健脾利水、消腫降濁功能增強(qiáng)；菖蒲開(kāi)竅醒神，化濕和胃，寧神益智；磁石鎮(zhèn)驚安神，平肝潛陽(yáng)，兩藥相配安神作用增強(qiáng)。桂枝溫陽(yáng)通脈，其與白芍相合，可強(qiáng)心利尿鎮(zhèn)靜。因此，該方機(jī)制可能與降低炎性因子IL-6、PGE2含量，依賴SOCS負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)。

本研究創(chuàng)新性地基于JAK-STAT/SOCS負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)通路，來(lái)討論眩暈方對(duì)CSR大鼠鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制研究，JAK/STAT信號(hào)通路是一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而SOCS家族主要作用在于負(fù)反饋調(diào)節(jié)該通路。本研究通過(guò)探論眩暈方對(duì)以上通路的作用，為緩解CSR患者的疼痛提供新思路。

綜上所述，眩暈方能夠?qū)SR大鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制與JAK-STAT信號(hào)通路與SOCS的交互作用，進(jìn)而降低炎癥因子水平相關(guān)。本研究為深入探討CSR分子治療途徑提供一定理論基礎(chǔ)。我們期望未來(lái)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上開(kāi)展臨床實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)下一步眩暈方生產(chǎn)的開(kāi)展，造福CSR患者。