承佳佳,王 琪,魏曉通,徐亞維
(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132101)
高純度DNA的取得是植物分子生物學(xué)研究中的關(guān)鍵,因此,探索快速、經(jīng)濟(jì)有效的DNA提取方法尤為重要[1]。本研究以玉米為材料,通過比較改良十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide,CTAB)法、十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)法、N-月桂酰胺法及植物基因組DNA快速提取試劑盒四種方法,探索最佳提取方法,為玉米的分子研究提供有效手段。
玉米種子,購自大潤(rùn)發(fā)超市。
Dzup(植物)基因組DNA快速抽提試劑盒購于上海生工生物有限公司;DL15000 DNA Marker 購于寶生物大連生物工程公司;其他試劑均為分析純。
0.2g玉米葉研至粉狀,加入改良CTAB提取液(50 mmol/L EDTA、1 mol/L NaCl、2.5 g/100 ml CTAB、0.1 g/100 ml NSL、1 ml/100 ml β-巰基乙醇)800 μl,65℃水浴30 min;4 ℃,12000 rpm離心15min,取酚:氯仿:異戊醇700 μl與上清混合,4℃離心5 min。加入冷異丙醇1 ml,4 ℃靜置30 min。12000 rpm離心5 min,70 μl TE與1 μl RNase溶解沉淀[2]。
0.2 g玉米葉研磨后加入SDS提取液(10 mmol/L Tris-HCl,pH值為8.0;25 mmol/L EDTA,pH值為8.0;100 mmol/L NaCl;0.5% SDS)800 μl,56℃水浴20 min。12000 rpm離心,上清加酚:氯仿:異戊醇700 μl,4℃靜置20 min后12000 rpm離心,上清加1 ml冷異丙醇,4℃靜置30min。12000 rpm離心10 min,70 μl TE溶解[1]。
0.2 g玉米葉研至粉狀,加入0.4 ml裂解液1,65 ℃裂解30 min,加130 μl裂解液2,4℃放置8 ~10 min,15000 rpm離心10 min。取500 μl上清液加入1.5 ml裂解液AP3/E混勻后移至吸附柱中,離心60sec。加600 μl漂洗液,離心1 min。13000 rpm空離心2 min,50μl EB溶解[1]。
0.2 g玉米葉研至粉狀,加600 μl緩沖液(500 ml含N-月桂酰肌氨酸鈉5 g,氯化鈉2.925 g,1 mol/L
Tris-HCl;0.5 mol/L的EDTA 20 ml;pH8.0),裂解5 min,上清加氯仿:異戊醇600 μl,離心10 min,上清加500μl冷異丙醇,4℃靜置30 min后離心5 min,70 μl TE溶解沉淀[2]。取四種方法提取的DNA進(jìn)行紫外和電泳鑒定。
理想DNA其A260/A280的比值在1.80和1.90間,但改良CTAB法提的DNA濃度最高,為471.38 ng/ml,SDS法最低,從經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)單的角度來講,改良CTAB法效果最佳。
四種方法均獲得了一定量純DNA,其中SDS法條帶亮度最淺,說明提取效果差;第2泳道雖然相對(duì)于第1和第3泳道,提取效果差不多,但試劑盒法價(jià)格高,因此,改良CTAB法條帶最度且無雜帶,提取效果最佳。
本研究對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改良,結(jié)果表明改良CTAB法提取的基因組純度和濃度都較高,證明此法對(duì)植物中小分子雜質(zhì)、多糖、酚類等雜志的去除效果較好[2]。盡管植物提取試劑盒和N-月桂酰肌氨酸鈉法也能獲得高質(zhì)量的基因組,但由于試劑盒造價(jià)高,N-月桂酰肌氨酸鈉試劑不常用,因此,作為次選。