新型冠狀病毒感染肺炎的實(shí)驗(yàn)診斷

陳福祥，羅清瓊，徐北惠

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，上海 200025）

自2019 年12 月開始，新型冠狀病毒（世界衛(wèi)生組織將其命名為2019 novel coronavirus，2019-nCoV）感染機(jī)體引起的肺炎首先在武漢暴發(fā)，此后，全國各地多處有報告新病例。新型冠狀病毒感染引起的疾病被世界衛(wèi)生組織命名為COVID-19（corona virus disease 2019）；而在國際病毒分類委員會聲明中，則將新型冠狀病毒命名為“SARSCoV-2”（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。目前，我國衛(wèi)生健康委員（衛(wèi)健委）發(fā)布的關(guān)于新型冠狀病毒肺炎暫命名事宜的通知，決定將“新型冠狀病毒感染的肺炎”暫命名為“新型冠狀病毒肺炎”，簡稱“新冠肺炎”。

我國已將新冠肺炎納入 《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并按甲類傳染病管理。

新冠肺炎起病隱匿，根據(jù)患者初期的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征無法對其進(jìn)行確診。盡早確定新型冠狀病毒感染與否不僅有助于患者及時得到規(guī)范化治療，防止病情延誤，更有助于及時切斷傳染源，控制疫情進(jìn)一步擴(kuò)散。因此，新型冠狀病毒感染相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測至關(guān)重要。目前，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測包括病毒本身或者其特異性組分和機(jī)體感染病毒后的反應(yīng)性產(chǎn)物，檢驗(yàn)項(xiàng)目多樣、方法各異，具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。本文將就此進(jìn)行初步分析和評價。

病毒感染病原學(xué)確診的依據(jù)

從送檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)出完整的病毒或檢測到其特異性組成成分（蛋白質(zhì)或者核酸）是新型冠狀病毒感染的直接證據(jù)和金標(biāo)準(zhǔn)。病毒分離培養(yǎng)因必須在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，且需報經(jīng)國家衛(wèi)健委批準(zhǔn)，取得相應(yīng)的資質(zhì)后方能進(jìn)行，限制了病毒分離培養(yǎng)在COVID-19 實(shí)驗(yàn)檢測中的普遍應(yīng)用。因此，目前針對新型冠狀病毒感染的實(shí)驗(yàn)檢測，主要是對其核酸進(jìn)行檢測。

一、核酸檢測及結(jié)果判斷

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》 指出，疑似病例送檢標(biāo)本行實(shí)時熒光RTPCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性或基因測序，如結(jié)果與已知的新型冠狀病毒高度同源，即可確診為新型冠狀病毒感染[1]。將新型冠狀病毒的全基因組序列與其他物種的基因組序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒與菊頭蝠攜帶的冠狀病毒BtCoV/4991 高度同源（98.7%），但進(jìn)化分析顯示其含有區(qū)別于其他病原體的特異RNA 序列[2]，提示如果能在患者的樣本中檢測到該序列，則提示該患者為新型冠狀病毒感染。實(shí)時熒光RT-PCR 檢測的是新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1ab 和核衣殼蛋白2 個序列[3]。同一份送檢標(biāo)本的開放讀碼框1ab 和核衣殼蛋白序列檢測結(jié)果同時陽性，該病例即可確認(rèn)為新型冠狀病毒感染；如果檢測結(jié)果僅為單個靶標(biāo)陽性，則需重新采樣檢測（可以是相同類型的標(biāo)本，也可以是不同類型的標(biāo)本），結(jié)果若仍為單個靶標(biāo)陽性，可判定為陽性。另外，如果2 種標(biāo)本的實(shí)時熒光RTPCR 同時出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，也可判定為新型冠狀病毒感染。

二、檢測相關(guān)的影響因素

作為新型冠狀病毒感染的確診方法，核酸檢測需避免出現(xiàn)“假陽性”和“假陰性”結(jié)果?！凹訇栃浴蓖ǔＳ蓸?biāo)本間交叉污染或?qū)嶒?yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染所致，因此，要求實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格按規(guī)范流程操作。另外，也可采取“3 個陰性樣本隨機(jī)放在臨床樣本中間，同時參與檢測全過程”的策略來對實(shí)時熒光RT-PCR 檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

樣本采樣部位不佳、采樣量不足、采樣過早或過晚、保存不當(dāng)及檢測試劑盒性能不佳等常導(dǎo)致“假陰性”結(jié)果。因此，需要規(guī)范采樣人員的操作，并根據(jù)實(shí)際情況采集合適的標(biāo)本[包括鼻和（或）口咽拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液、血液、眼結(jié)膜拭子或糞便等]?！缎滦凸跔畈《痉揽胤桨浮分袑颖镜牟杉吞幚碛性敿?xì)的描述，故在此不再贅述。

另外，由于新型冠狀病毒為RNA 病毒，易被外源性或細(xì)胞破壞后釋放的RNA 酶降解，所以標(biāo)本采集后應(yīng)低溫保存、運(yùn)送，并盡快進(jìn)行檢測。此外，由于本次疫情發(fā)展迅猛，市場上現(xiàn)有的核酸檢測試劑盒前期性能驗(yàn)證不完善，品牌之間的檢測性能參差不齊。因此，當(dāng)核酸檢測結(jié)果為陰性但臨床非常懷疑患者為新型冠狀病毒感染時，建議多次采樣，并采用多種試劑進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。

病毒感染后機(jī)體反應(yīng)性產(chǎn)物的檢測

新型冠狀病毒作為一種外源性的致病原入侵機(jī)體后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能迅速對其識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而反應(yīng)性地出現(xiàn)免疫細(xì)胞亞群比例及活化狀態(tài)的改變，并伴隨細(xì)胞因子及特異性抗體的產(chǎn)生。另外，隨著疾病的進(jìn)展，與疾病相關(guān)的某些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)也會反應(yīng)性地升高。

一、免疫細(xì)胞亞群分析

“非典”疫情之后，大量研究成果顯示，宿主免疫狀態(tài)評估在嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）的診斷、治療和發(fā)病機(jī)制研究中有著重要作用。在對急性期和恢復(fù)期SARS 病例的研究中發(fā)現(xiàn)，急性期患者的T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK 細(xì)胞）的數(shù)目明顯低于正常人[4]；SARS 病毒可在患者外周單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制[5]，樹突細(xì)胞在發(fā)病最初2 周數(shù)目減少，在恢復(fù)期緩慢恢復(fù)至正常值[6]。

研究報道，在COVID-19 患者發(fā)病早期，外周血白細(xì)胞總數(shù)正常或減少，但淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少。有研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19 患者外周血CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，但活化細(xì)胞比例明顯上升，表現(xiàn)為CD4+T 淋巴細(xì)胞中CCR4+CCR6+Th17 比例及CD8+T 淋巴細(xì)胞中穿孔素和(或)顆粒溶素表達(dá)增加，提示這些免疫細(xì)胞參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)[7-8]，但其具體的應(yīng)答機(jī)制目前尚不清楚。

從國家衛(wèi)建委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》和目前公布的臨床研究結(jié)果來看，淋巴細(xì)胞總體數(shù)量下降與新型冠狀病毒感染患者的病情進(jìn)展相關(guān)，特別是與重癥及死亡患者的病程特征間有很強(qiáng)的相關(guān)性。因此，結(jié)合以往治療SARS 的經(jīng)驗(yàn)[9-10]，對患者外周血標(biāo)本中CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞及其亞群甚至其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等的檢測，將有助于COVID-19 的輔助診斷，并對新型冠狀病毒感染患者的預(yù)后及治療監(jiān)測具有一定指導(dǎo)意義。

二、細(xì)胞因子檢測

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，但其作用是把“雙刃劍”，適宜水平的細(xì)胞因子可以抑制病毒復(fù)制和傳播，而過高水平的細(xì)胞因子則會加劇組織損傷?！凹?xì)胞因子風(fēng)暴”又稱細(xì)胞因子釋放綜合征，即由于免疫系統(tǒng)過度激活導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子急劇升高的現(xiàn)象[11]，可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征和多臟器衰竭。

研究顯示，季節(jié)性流感病毒甲型流感病毒感染的重癥患者體內(nèi)輔助性T 淋巴細(xì)胞1 和輔助性T 淋巴細(xì)胞17 的分泌水平更高，白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-12 等細(xì)胞因子是危重癥的標(biāo)志[12]。SARS 患者體內(nèi)的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”主要涉及IL-1β、IL-6、IL-12、γ 干擾素、干擾素誘導(dǎo)蛋白10 及單核細(xì)胞趨化蛋白1 等，而中東呼吸綜合征患者主要致病細(xì)胞因子為γ 干擾素、腫瘤壞死因子α、IL-15 和IL-17[13]。

在此次新型冠狀病毒感染的肺炎疫情中，“細(xì)胞因子風(fēng)暴”也成為導(dǎo)致重癥和危重癥COVID-19患者死亡的重要原因之一。研究表明，相對于非重癥監(jiān)護(hù)患者，重癥監(jiān)護(hù)患者的血漿中存在更高水平的IL-2、IL-7 以及腫瘤壞死因子α[14]；新型冠狀病毒感染機(jī)體后迅速激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞，通過粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-6通路，形成炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部免疫損傷[15]；使用阻斷IL-6 通路的藥物“托珠單抗”后，可不同程度地改善重癥患者呼吸功能氧合指數(shù)，使部分患者肺部病灶吸收好轉(zhuǎn)[15]。因此，通過檢測外周血中細(xì)胞因子水平的變化也可輔助判斷COVID-19 患者的預(yù)后、監(jiān)測病程，拮抗某些關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子，還可以對疾病進(jìn)行輔助治療。

三、抗體檢測

病毒感染后7 d 左右，機(jī)體可產(chǎn)生針對病毒的特異性抗體。因此，血液標(biāo)本中特異性抗體的檢測也可反映病毒感染的存在?？贵w檢測方法很多（免疫膠體金方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光測定等），目前已有部分廠家研發(fā)出針對新型冠狀病毒IgG 和（或）IgM 的抗體檢測試劑盒。前期，對70 例確診患者血液樣本進(jìn)行檢測研究后發(fā)現(xiàn)，IgG 的陽性率為77.14%，IgM 陽性率為35%[16]，關(guān)于血液樣本抗體檢測的評價，尚需要更多的臨床研究加以佐證。但抗體檢測無疑將成為除核酸檢測外判斷新型冠狀病毒感染的另一有利手段。因?yàn)楹怂釞z測雖然在確診新型冠狀病毒感染中具有不可替代的作用，但由于其操作繁瑣、耗時長、對實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員要求高，不適宜用于疑似患者和密切接觸人群的快速篩查，而特異性抗體的檢測恰可彌補(bǔ)這一缺陷，可實(shí)現(xiàn)快速、大規(guī)模、批量操作，且可降低醫(yī)務(wù)人員在呼吸道樣本采集過程中的暴露風(fēng)險。

需要注意的是，由于從病毒進(jìn)入機(jī)體到機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體需要一段時間（窗口期）以及檢測試劑盒的靈敏度不一致，抗體檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)“假陰性”的情況；另外，受血液標(biāo)本中的某些干擾物質(zhì)（如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等）的影響，抗體檢測也可出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果。因此，檢測抗體時，通常需聯(lián)合檢測IgM和IgG，且建議多次檢測并觀察動態(tài)效價予以確認(rèn)。

四、其他相關(guān)指標(biāo)的檢測

肌鈣蛋白I 或肌鈣蛋白T 是心肌損傷的特異性血清標(biāo)志物，新型冠狀病毒感染中度或重癥患者因呼吸系統(tǒng)受損、氧合不足，從而導(dǎo)致心肌缺血性損傷釋放肌鈣蛋白I 或肌鈣蛋白T。肌鈣蛋白I 或肌鈣蛋白T 的檢測有助于判斷新型冠狀病毒感染患者的心肌損傷程度以及預(yù)后風(fēng)險。D-二聚體是反映凝血功能的指標(biāo)，也是肺栓塞的排除指標(biāo)。新型冠狀病毒感染重型病例多在1 周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，因此，D-二聚體水平可反映病情進(jìn)展。另外，重癥肺炎會導(dǎo)致多器官衰竭，加重心臟負(fù)擔(dān)，尤其對于有心臟基礎(chǔ)疾病的患者，更容易發(fā)生心力衰竭（心衰）等事件。腦鈉肽是診斷心衰的首選指標(biāo)，可用于急性冠狀動脈綜合征的危險分級評估，是心臟功能的評估指標(biāo)。檢測腦鈉肽，一方面有助于鑒別新型冠狀病毒感染引發(fā)的呼吸困難與心衰引發(fā)的呼吸困難，另一方面可用于評估重癥患者的病情進(jìn)展。因此，在對疑似及確診新型冠狀病毒感染患者進(jìn)行救治時，檢測肌鈣蛋白I 或肌鈣蛋白T、D-二聚體和腦鈉肽有助于判斷病情及鑒別診斷，減少等待時間，提高救治效率。

此外，C 反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率和降鈣素原等對新型冠狀病毒感染也具有一定的輔助診斷價值。部分新型冠狀病毒感染患者還可見丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶及肌紅蛋白升高。

小 結(jié)

無論是判斷患者的預(yù)后還是疫情防控的需要，盡早確診新型冠狀病毒感染都十分重要。核酸檢測作為目前新型冠狀病毒感染患者的實(shí)驗(yàn)診斷確診方法之一，各種因素導(dǎo)致其對新型冠狀病毒感染的檢出率僅在30%～50%，因此，合理地聯(lián)合其他項(xiàng)目檢測將有助于疾病的診斷和鑒別診斷?？贵w檢測是一個較好的輔助篩查指標(biāo)，其檢測相對快速、靈活、便捷，但其試劑盒開發(fā)還需加快進(jìn)程，以盡快投入臨床應(yīng)用。細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞特別是淋巴細(xì)胞亞群和其他疾病相關(guān)指標(biāo)的檢測，有助于新型冠狀病毒感染的疾病進(jìn)程判斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估。