非蛋白質類膠結物免疫法在美術繪畫作品中檢測分析

張曉紅

摘 要：對美術繪畫作品中的膠結物進行成分分析，是繪畫作品保護和修復工作的基礎。文章以桃膠為例，對美術繪畫作品非蛋白質類膠結物免疫法檢測進行實驗分析，結果表明：使用0.05M NaCl洗脫桃膠糖蛋白粗提產物，能夠獲得最高的蛋白質式樣占比;實驗樣本桃膠抗血清效價均能夠達到1：240000，試樣1相比試樣2略低;在抗體靈敏度檢測實驗中，實驗樣本可檢測最大稀釋倍數(shù)分別為105、106的桃膠抗原，差距明顯;對抗體靈敏度較高的試樣2進行抗體特異性檢測，該試樣抗血清對桃膠、大漆的反應活性較高，能夠檢測濃度低至10-6的桃膠抗原以及10-9的大漆。

關鍵詞：繪畫作品;膠結物;抗體靈敏度;特異性檢測

中圖分類號：TQ620.72 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-5922（2020）10-0039-04

Abstract：The composition analysis of cement in fine arts and paintings is the basis for the protection and restoration of paintings. Taking peach gum as an example， this paper makes an experimental analysis on the immunoassay of non protein cement in art and painting works. The results show that the highest proportion of protein pattern can be obtained by eluting the crude product of peach gum protein with 0.05MNaCl; the peach gum antiserum titer of the experimental samples can reach 1：240000， and the sample 1 is slightly lower than the sample 2; in the antibody sensitivity test， the experimental samples can detect peach gum antigens with the maximum dilution factor of 105 and 106 respectively， and the difference is obvious; the antibody specificity test is carried out on sample 2 with high antibody sensitivity. The antiserum of this sample has high reaction activity to peach gum and lacquer， and can detect the peach gum antigens with the concentration as low as 10-6 and lacquer with the concentration as low as 10-9.

Key words：painting works; cement; antibody sensitivity; specificity test

0 引言

膠結物是各類型美術繪畫作品（包括油畫、壁畫、彩繪等）顏料層的重要組成部分[1]。繪畫創(chuàng)作人員經常使用天然生物材料如蛋清、桃膠、動物皮膠等材料用作繪畫創(chuàng)作中顏料的調和劑。針對美術繪畫作品中的膠結材料進行成分分析，不僅能夠對某些珍稀繪畫作品的創(chuàng)作歷程進行追溯，同時還能夠有效解決美術繪畫作品加固和保存防護難題，對于美術事業(yè)的發(fā)展具有重要的技術和經濟價值。然而，由于一般美術繪畫作品中膠結物的含量較少且雜質多、易老化流失，一般的膠結材料檢測技術難以對美術繪畫作品中的膠結物成分進行準確分析。

免疫分析技術是在現(xiàn)代分子生物學基礎上，利用抗體與抗原之間的特異反應所構建的一種新式膠結材料檢測手段，能夠以極高的靈敏度檢測某物質中的生物源分子，從而進行有效的膠結材料成分鑒別[2]。文章基于免疫法原理，對該方法在美術繪畫作品膠結物成分檢測工作中的應用效果進行驗證。實驗結果表明：利用免疫法在美術繪畫樣品和橫截面切片上進行非蛋白質類膠結物檢測，能夠準確判斷該繪畫作品各層中摻加的有機膠結物信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

一般繪畫用品常用蛋白質類膠結材料有：蛋清、牛乳、動物皮膠等蛋白質類膠結材料以及桃膠、桐油、櫻桃膠、松香等非蛋白質類膠結材料[3]。利用免疫法對蛋白質類膠結物的研究和技術已經比較成熟，而針對非蛋白質類膠結物方面的檢測研究則相對較少，技術也相對匱乏。本試驗選擇產自我國湖北隨州市的美術繪畫用特級桃膠作為實驗用主要原材料。不同樹種桃膠中多糖的單糖組成以及蛋白質、雜質的含量各不相同，本實驗用桃膠主要成分含量如表1所示[4]。

除表1中所需實驗用桃膠原材料外，本試驗所需實驗試劑和儀器籌備情況見表2。

1.2 實驗方法

桃膠與阿拉伯膠相似，均屬酸性多糖且主要成分均由半乳糖、阿拉伯糖等構成[5-7]。利用免疫法對繪畫作品中的阿拉伯膠成分進行檢測的研究較為為多見，如英國切斯特大學同一課題組分別于2004年、2006年和2010年運用不同方法對阿拉伯膠、熟化處理阿拉伯膠以及魔芋葡甘聚糖等的多糖成分進行抗體特異性分析，得到了可以用于檢測阿拉伯膠的針對性抗體[8、9]。為簡化實驗流程、提升實驗可信度，本次實驗采用仿照該課題組實驗方法，按1.3實驗步驟培養(yǎng)特異性針對桃膠的抗體。

1.3 實驗步驟

對桃膠原材料進行提純，得到待檢測的桃膠糖蛋白;將所得試樣分別注入兔子1號、2號實驗體內進行多克隆抗體培養(yǎng);將抗體培養(yǎng)工作交由陜西嘉禾生物科技股份有限公司進行。具體提純過程如下：

1）粗提。將桃膠進行粉碎并進行90℃條件下的熱水浴;擱置12h后進行抽濾并提取濾液。

2）凍干。利用默克 美國密理博公司生產的最新10kDa超濾管對濾液進行過濾濃縮;按照V濾液/V乙醇=1/3加入乙醇溶液，置于冷藏箱中（t=5℃）進行12h靜置后進行過濾、取沉淀，將獲取沉淀物放入冷凍干燥機中進行凍干。

3） DEAE-52纖維素預處理.取50g纖維素試樣按照V纖維素/V蒸餾水=1/10比例進行浸泡（T=1h）。在纖維素得到充分溶脹后進行洗滌，去除溶液中的懸浮顆粒;對溶液進行抽濾后用0.5mol/L的NaOH溶液進行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復沖洗至溶液PH=7;用0.5mol/L的HCl溶液進行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復沖洗至溶液PH=7;最后再用0.5mol/L的NaOH溶液進行浸泡（T=1h），再用蒸餾水反復沖洗至溶液PH=7;經過“堿-酸-堿”反復處理后，纖維素將與溶液中的OH-離子進行結合，從而獲得與桃膠中的糖蛋白陰離子進行交換的能力。對所得溶液進行裝柱、平衡處理，獲得能夠進行柱層析上樣的溶液。

4）上樣、洗脫和收集。取V=2ml的柱層析上樣溶液，按照洗脫速度為0.5mL/min條件進行洗脫處理。首先，以0.002Mtris-HCL溶液作為緩沖液，對桃膠溶液試樣中未完全被吸附的桃膠糖蛋白進行洗脫;其次，利用0.05M～0.40M的NaCl溶液進行洗脫;最后用分部收集器對最終洗脫所得的溶液進行收集，每管收集6mL。

5）檢測：①紫外分光光度法檢測蛋白質。利用紫外分光光度計對桃膠式樣進行糖蛋白檢測，利用蛋白質中的氨基酸殘基苯環(huán)共軛體系對紫外光波段的吸收特征，選擇275至280nm波段中的最大值進行檢測，得到溶液中桃膠糖蛋白質的濃度;②苯酚-硫酸法檢測糖類。該法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法進行糖類測定的方法。

2 結果與分析

2.1 糖蛋白分離純化

利用DEAE-52纖維素對檢測桃膠試樣進行糖蛋白純化，得到圖1所示的桃膠糖蛋白洗脫曲線圖。

由圖1中數(shù)據(jù)可知，利用DEAE-52纖維素對桃膠蛋白進行洗脫的過程中，四種比例的纖維素均能夠獲得洗脫峰，但0.05M NaCl處獲得洗脫峰值最高，峰面積最大;0.1M NaCl處獲得洗脫峰值最低，峰面積最小。說明在0.05處所得到的桃膠蛋白比例最高。因此，本試驗將0.05處洗脫所得試樣進行乙醇沉淀，得到能夠用于抗血清培養(yǎng)的純化蛋白質。

2.2 抗血清效價測定

以1、2號兩只實驗用兔子為例進行間接ELISA法測定抗血清效價。得到表3所示的桃膠抗血清效價結果。

根據(jù)測定的OD450-630來確定兩試樣的抗血清效價原則可知，試樣測定OD450-630數(shù)值大于BSA數(shù)值情況下，即可認定試樣效價抗血清稀釋倍數(shù)能夠達到效價要求[10]。經實驗所得數(shù)據(jù)可知，兩試樣的效價均能夠達到1：240000。其中2號試樣的抗血清效價略高于1號試樣。

2.3 抗體靈敏度檢測

按照1：500條件對桃膠溶液進行稀釋，從而檢測試樣對不同抗原稀釋倍數(shù)的響應值，從而測定1、2號試樣抗體靈敏度，最終得到表4所示兩試樣桃膠抗體靈敏度結果見表4。

由表4中數(shù)據(jù)可知，同等桃膠稀釋倍數(shù)條件下1號試樣抗血清的響應值相對2號而言略低，在桃膠稀釋倍數(shù)超過1：105（不含）以后不再具備可以實際應用的桃膠抗體靈敏度;2號試樣在桃膠稀釋倍數(shù)超過1：106（不含）以后不再具備可以實際應用的桃膠抗體靈敏度，比1號試樣情況略好。

2.4 抗體特異性檢測

由于2號試樣對桃膠稀釋溶液的抗體靈敏度更高，因此本試驗在抗體特異性檢測環(huán)節(jié)選擇2號試樣作為實驗樣本，分別進行桃膠、大漆、動物膠、蛋清、牛乳、松香、蜂蠟等的反應活性檢測。按照抗原濃度和抗體濃度分別為1：1000和1：500進行檢測，得到圖2所示檢測結果。

由圖2可知，2號試樣抗血清對動物膠、蛋清等的反應活性較低，但是對桃膠和大漆的反應活性較高。本試驗根據(jù)這一結果重新進行桃膠和大漆的反應活性對比實驗，得到表5所示結果。

由表5中數(shù)據(jù)可知，2號試樣抗體血清在檢測濃度低至1：106桃膠稀釋溶液時仍能夠保持較高的反應活性，檢測效果優(yōu)秀;然而該血清在對大漆稀釋溶液進行抗體檢測時能夠檢測最低達1：109的大漆抗原。表明該抗血清盡管能夠準確檢測桃膠抗原但是一旦檢測過程中溶液混合了大漆抗原，則容易影響檢測精度，無法幫助檢測人員獲得精準檢測結果。

3 結語

在充分吸收西方相關學者研究經驗基礎上，本試驗提出了一套非蛋白質類膠結物的檢測方法。通過實驗分析可知：

1） 0.05M NaCl處洗脫所得桃膠試樣進行乙醇沉淀，能夠得到能夠用于抗血清培養(yǎng)的最佳純化蛋白質;

2）對試樣1、2號兔子進行抗血清效價測定，兩試樣的效價均能夠達到1：240000。其中2號試樣的抗血清效價略高于1號試樣。

3）在抗體靈敏度檢測實驗中，2號試樣能夠在桃膠稀釋倍數(shù)超過1：106之前具備可以實際應用的桃膠抗體靈敏度，比1號試樣情況略好。

4）在抗體特異性檢測實驗中，2號試樣能夠對桃膠呈現(xiàn)出非常高效的反應活性，但對大漆抗原的反應活性更高。

綜合分析，利用免疫法對美術繪畫作品中的非蛋白質類膠結物進行檢測，能夠獲得較好的檢測精度和反應活性，但是一旦該繪畫作品中存在大漆抗原，則檢測結果并不完全可靠。

參考文獻

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