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    GhMYB43 負(fù)調(diào)控木質(zhì)素的生物合成和茉莉酸信號(hào)

    2020-12-08 03:59:10沈吉麗肖勝華惠慧努日曼古麗艾尼胡琴張曉君楊兆光聶新輝朱龍付
    棉花學(xué)報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:黃萎病木質(zhì)素棉花

    沈吉麗,肖勝華,惠慧,努日曼古麗·艾尼,胡琴,張曉君,楊兆光,聶新輝*,朱龍付*

    (1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 石河子832000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430070)

    棉花(Gossypium hirsutum)是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,已在世界范圍內(nèi)種植,而病害是其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素[1]。 黃萎病在中國(guó)是棉花生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一[2]。 木質(zhì)素是維管束植物次級(jí)細(xì)胞壁(Secondary cell wall,SCW)的重要成分[3]。 木質(zhì)素的生物合成受發(fā)育信號(hào)和環(huán)境刺激的控制,例如紫外線(xiàn)照射、傷口和病原侵染[4-5]。 在擬南芥中,SG2 型R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)MYB15 是防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化和先天免疫的調(diào)節(jié)因子[6]。 GhLac15 通過(guò)增強(qiáng)防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化來(lái)提高對(duì)黃萎病的抗性[7]。 盡管已經(jīng)報(bào)道了涉及木質(zhì)素生物合成的許多基因,但是目前在棉花中報(bào)道的調(diào)控木質(zhì)素生物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子還很少。

    茉莉酸(Jasmonic acid,JA)是1 種脂源性植物激素, 可調(diào)節(jié)植物免疫和發(fā)育的各個(gè)方面[8-9]。曾報(bào)道GbWRKY1 在JA 介導(dǎo)的防衛(wèi)基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中具有明顯的負(fù)調(diào)控作用,這表明GbWRKY1可能是通過(guò)負(fù)調(diào)控JA 信號(hào)通路(轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)在植物抗病性反應(yīng)中起作用。 GhHB12 參與對(duì)大麗輪枝菌(Verticlillium dahliae)和JA 信號(hào)的響應(yīng),并且GhHB12 僅抑制某些JA 響應(yīng)基因(GhJAZ2和GhPR3)表達(dá),但不抑制棉花的整個(gè)JA 信號(hào)通路[10-11]。 如何激活棉花與大麗輪枝菌互作過(guò)程中JA 的合成和信號(hào)通路尚待探索。

    植物轉(zhuǎn)錄因子MYB 是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過(guò)程有關(guān)[12]。 已通過(guò)遺傳分析和分子分析對(duì)MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在許多植物物種中的功能進(jìn)行了研究, 例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、矮牽牛 (Petunia hybrida)、 金魚(yú)草(Antirrhinum majus)、 葡萄 (Vitis vinifera L.)、 楊樹(shù)(Populus tremuloides) 和蘋(píng)果 (Malus domestica)[13]。 At-MYB125 是控制雄性生殖細(xì)胞分裂和分化的花粉特異性因子[14];AtMYB33 和AtMYB65 促進(jìn)了花藥和花粉的發(fā)育[15];MYB189 在擬南芥和毛果楊(P.trichocarpa)中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的含量顯著降低,并且使莖中的維管發(fā)育受到明顯抑制,導(dǎo)致木質(zhì)部纖維的次生細(xì)胞壁厚度顯著降低[16]。 SlMYB21 對(duì)JA 生物合成具有正向調(diào)節(jié)作用,而對(duì)生長(zhǎng)素和赤霉素則具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果表明,SlMYB21 至少部分介導(dǎo)JA 的作用,并可能控制花到果的過(guò)渡[17]。然而,關(guān)于MYB 在棉花防御反應(yīng)中調(diào)控JA 信號(hào)通路的作用的報(bào)道很少。

    近年來(lái),棉花黃萎病的發(fā)生給棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響,并且陸地棉中缺乏有效的抗源。 抗病基因鑒定及其抗病機(jī)制研究對(duì)于棉花多抗種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。 因此,本研究篩選到1 個(gè)GhLac1 上游的R2R3-MYB類(lèi)調(diào)節(jié)因子基因,通過(guò)超表達(dá)和病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技術(shù),對(duì)其功能進(jìn)行初步鑒定,進(jìn)一步探討棉花對(duì)黃萎病的反應(yīng)機(jī)制,為棉花抗病育種提供理論依據(jù)和基因資源。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    供試植物材料: 黃萎病感病品種陸地棉Jin668(G.hirsutum L.cv.Jin668),耐病品種海島棉7124(G.barbadense L.cv.7124,簡(jiǎn)稱(chēng)“海7124”)及陸地棉YZ1 (Gossypium hirsutum cv.YZ1),均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花課題組保存。

    煙草材料為本氏煙(Nicotiana benthamiana),種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花樓附樓光照培養(yǎng)室。

    1.2 酵母單雜交(Yeast one hybrid, Y1H)

    將目的基因啟動(dòng)子(Bait) 重組在載體質(zhì)粒pHISi-1 上, 將重組好的質(zhì)粒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)陽(yáng)性檢測(cè),并測(cè)序比對(duì),保證目的序列無(wú)突變。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Y1H 菌株涂布于含有0、15、30 mmol·L-13-氨基-1,2,4- 三唑(3-AT)的SD/-Trp/-His 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上,進(jìn)行酵母互作分析,將培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6 d, 觀察菌斑的生長(zhǎng)情況[18]。

    1.3 GhMYB43 基因的序列分析和植物轉(zhuǎn)化

    GhMYB43 基因的全長(zhǎng)序列可從網(wǎng)站https://cottonfgd.org/ 獲得。 分別使用ClustalX(http://www.clustal.org/)和MEGA5(http://www.megasoftware.net/)比對(duì)氨基酸序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    從Jin668 克隆全長(zhǎng)GhMYB43, 并通過(guò)attB與attP 位點(diǎn)(BP)重組和attL 與atRR 位點(diǎn)重組(Invitrogen)插入Gateway 載體pK2GW7.0(Ghent University)中,以生成過(guò)表達(dá)載體。根據(jù)先前的研究方法[19],通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(菌株GV3101)介導(dǎo)法用GhMYB43 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Jin668。

    1.4 供試菌株、載體

    所用的菌株是大腸桿菌TOP10 和根癌農(nóng)桿菌GV3101 菌株, 它們均由本研究小組儲(chǔ)存在20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的甘油中,并儲(chǔ)存在-80 ℃的超低溫冰箱中。

    所用的載體:中間載體pDONER221、pDONERZ60、pGBKT7、pGADTT7 等,亞細(xì)胞定位載體pMDC43, 均 保 存 在-80 ℃;VIGS 中 間 載 體pTRV1、pIRV2、pTRVCLA,由荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Bart P. H. J. Thomma 教授提供, 保存在本課題組; 超表達(dá)載體pGWB409 和干涉載體pHellsgate4 保存于本課題組。

    1.5 棉花DNA 及RNA 的提取

    棉花DNA 提取主要參照天根植物DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech,DP305),具體操作步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。 采用天根生化科技有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(DP441)提取棉花不同組織的RNA。

    1.6 RNA 逆轉(zhuǎn)錄(RT)及實(shí)時(shí)定量PCR 分析

    從-80 ℃冰箱中取出提取備用的RNA,通過(guò)0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)(Thermo)測(cè)定核酸濃度。 RNA 逆轉(zhuǎn)錄具體操作步驟:①基因組DNA 的除去反應(yīng)。 加入2.0 μL 的5×gDNA Eraser Buffer,1.0 μL 的 gDNA Eraser,RNA 總量≤1.0 μg, 用RNA Free ddH2O 補(bǔ)充體系到10.0 μL。 于42 ℃溫浴2 min 或者室溫放置30 min,放于4 ℃冰箱或置于冰上備用。 ②RNA逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng)。 5×PrimeScriptBuffer 2(Real Time)4.0 μL,1.0 μL PrimeScriptRT Enzyme Mix Ⅰ,1.0 μL RT Primer Mix,10.0 μL 的步驟①反應(yīng)液,4.0 μL RNase Free ddH2O。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37 ℃的水浴中進(jìn)行15 min (或用PCR 儀完成此步),然后酶滅活反應(yīng)在85 ℃的高溫水浴中進(jìn)行5 s,將合成的cDNA 置于-20 ℃冰箱保存。

    RT-qPCR 具體操作步驟: 將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 取出,加水稀釋100 倍后作為反應(yīng)模板。先加入SYBR Green mix(Bio-Rad),7.5 μL;再加入正反向引物各0.25 μL;最后,加入稀釋好的cDNA模板。 使用ABI Prism 7500 Sequence Detection System 儀器和軟件(Applied Biosystems,USA)檢測(cè), 程序?yàn)?5 ℃1 min,95 ℃15 s,60 ℃35 s,40個(gè)循環(huán)。 每個(gè)反應(yīng)3 次生物學(xué)重復(fù)。 本研究所用RT-qPCR 引物序列見(jiàn)表1。

    表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primers used in this study

    1.7 亞細(xì)胞定位分析

    采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法, 用構(gòu)建好的35S∷Gh-MYB43-GFP 融合表達(dá)載體、空載體(35S-GFP)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。按照煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法,選取培養(yǎng)3 周的煙草,將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液注射到完整且平展的煙草葉片中。 注射后對(duì)侵染的煙草葉片避光處理,48 h 后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

    1.8 VIGS 分析

    使用BamHⅠ和KpnⅠ將GhMYB43 的cDNA 序列克隆到基于煙草脆裂病毒(Tobaceo rattle virus, TRV) 的質(zhì)粒中, 以構(gòu)建TRV∷Gh-MYB43 VIGS 載體,然后如前所述通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101 中[19]。如前所述[20],使用無(wú)針注射器將攜帶TRV∷00(對(duì)照)和TRV∷GhMYB43 載體的農(nóng)桿菌注射到已生長(zhǎng)10 d 的海7124 幼苗的子葉中。侵染約10 d 后,從棉花根中提取RNA 以測(cè)定GhMYB43 的表達(dá)水平。 保持在25~28 ℃的恒定溫度下,光周期(暗/ 光)為8 h/16 h,相對(duì)濕度為60%。

    1.9 超表達(dá)載體的構(gòu)建

    根據(jù)獲得的全長(zhǎng)GhMYB43 cDNA 設(shè)計(jì)引物。 將SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基分別添加到引物的兩端。然后,以GhMYB43 基因的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 產(chǎn)物用SacⅠ和XbaⅠ酶切, 并用DNA Recovery Kit(Qiagen DNA 回收試劑盒)回收。pGEB409 和pHellsgate4也用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切, 大片段用DNA Recovery Kit 回收。 將回收的PCR 片段與大載體片段在4 ℃下連接,并通過(guò)PCR 驗(yàn)證連接產(chǎn)物。 將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)和干涉載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。

    1.10 Southern 雜交(地高辛標(biāo)記法)

    為確定轉(zhuǎn)GhMYB43 基因株系的DNA 序列拷貝數(shù),采用植物基因組DNA 試劑盒DP305(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。用HindⅢ(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室) 酶切20 mg 基因組DNA 60 h, 根據(jù)制造商的說(shuō)明, 使用DIG-High Prime DNA 標(biāo)記和檢測(cè)起始試劑盒Ⅱ(Roche)進(jìn)行Southern 雜交。 用nptⅡ基因片段作為探針檢測(cè)拷貝數(shù)。

    1.11 黃萎病菌接種和病情分析

    用大麗輪枝菌菌株V991 接種Jin668(野生型,WT) 和轉(zhuǎn)基因系的幼苗。 保持培養(yǎng)在25~28 ℃的恒定溫度下,光周期(暗/ 光)為8 h/16 h,相對(duì)濕度為60%。持續(xù)觀察病情。每處理使用至少25 株的病情指數(shù)和發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并重復(fù)至少3 次。 根據(jù)Xu 等[21]公式計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率。

    1.12 組織化學(xué)染色和總木質(zhì)素含量的測(cè)定

    在接種后第13 天, 從接種的棉花和經(jīng)水處理的棉株根部手工切出橫截面。 使用Wiesner 試劑檢查木質(zhì)素的組織化學(xué)。 將根部橫截面在體積分?jǐn)?shù)4%的間苯三酚溶液 (其中乙醇體積分?jǐn)?shù)95%)或95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(染色對(duì)照)中孵育10 min, 然后用9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HCl 處理5 min,然 后 直 接 用 立 體 顯 微 鏡(MZFLIII,Leica,Wetzlar,德國(guó))觀察。

    根據(jù)以前的研究[22],使用木質(zhì)素- 巰基乙酸反應(yīng)確定無(wú)蛋白的細(xì)胞壁餾分中根和幼葉的木質(zhì)素含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),以干物質(zhì)計(jì)),至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GhMYB43 基因的克隆及序列特征分析

    在以前的研究中,證明超量表達(dá)棉花漆酶基因GhLac1 能增強(qiáng)棉花對(duì)各種病蟲(chóng)害的廣譜抗性[23]。通過(guò)Y1H 技術(shù)從棉花轉(zhuǎn)錄因子酵母文庫(kù)中篩選到與GhLac1 啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Gh_D12G0544。 生物信息學(xué)初步分析結(jié)果顯示,其編碼基因位于陸地棉D(zhuǎn)t 亞組第12 號(hào)染色體上,開(kāi)放閱讀框?yàn)? 131 bp,包含2 個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子,編碼1 個(gè)含376 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì) (圖1)。 根據(jù)NCBI 的Protein 數(shù)據(jù)庫(kù)和Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的Gh_D12G0544 在不同物種中的同源序列,并考慮物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,選取甜橙(Citrus sinensis)、榴蓮(Durio zibethinus)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、哥倫比亞錦葵(Herrania umbratica)、胡楊(Populus euphratica)、可可樹(shù)(Theobroma cacao)、金絲小棗(Ziziphus jujuba)、擬南芥等物種的Gh_D12G0544同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),發(fā)現(xiàn)該蛋白與擬南芥中AtMYB43 和雷蒙德氏棉中GrODORANT1 同源性最高,因此命名為GhMYB43。氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),GhMYB43 含有2 個(gè)MYB 結(jié)構(gòu)域,屬于典型的R2R3 類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子(圖2)。

    圖1 GhMYB43 的基因克隆和結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Gene cloning and structure analysis of GhMYB43

    2.2 GhMYB43 基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

    在GhMYB43 的3' 非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'UTR)設(shè)計(jì)特異引物,通過(guò)組織轉(zhuǎn)錄模式分析發(fā)現(xiàn),GhMYB43 在莖中優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄,在其他組織中略有轉(zhuǎn)錄(圖3a)。 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析表明,GhMYB43 受水楊酸(Salicylic acid, SA)和H2O2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平上升(圖3b、c), 而受茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, Me-JA) 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平下降(圖3d)。由此猜測(cè)GhMYB43 可能參與了這些激素信號(hào)通路的調(diào)控。 而在接菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析中,發(fā)現(xiàn)GhMYB43 在接菌后6 h、12 h、24 h 時(shí)受誘導(dǎo)顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄,而在48 h 后又受誘導(dǎo)下調(diào)轉(zhuǎn)錄(圖3e),推測(cè)GhMYB43 可能參與棉花抗黃萎病調(diào)控。

    2.3 GhMYB43 亞細(xì)胞定位分析

    通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)化空載體(35S-GFP)的煙草幼嫩葉片細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中均能觀察到綠色熒光, 而35S∷GhMYB43-GFP 與核標(biāo)記基因AtHY5-RFP 共定位于細(xì)胞核(圖4)。因此,認(rèn)為GhMYB43 是1 個(gè)核定位蛋白,符合一般轉(zhuǎn)錄因子特征。

    2.4 GhMYB43 自激活活性分析

    在棉花原生質(zhì)體中利用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)GhMYB43 的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行驗(yàn)證, 結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件(25 ℃培養(yǎng)16 h)下,與空載體(Control)對(duì)比,融合GAL4DB 的GhMYB43蛋白對(duì)熒光素酶有2.4 倍的轉(zhuǎn)錄激活活性 (圖5)。初步證實(shí),GhMYB43 是1 個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。

    2.5 GhMYB43 負(fù)調(diào)控棉花對(duì)黃萎病菌的抗性

    通過(guò)對(duì)以棉花Jin668 為受體材料遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行拷貝數(shù)分析(Southern blotting)以及轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定,篩選了轉(zhuǎn)錄水平符合預(yù)期的、 低拷貝的3 個(gè)超表達(dá)株系OE-77、OE-81 和OE-8 進(jìn)行后續(xù)研究 (圖6a、b)。 對(duì)超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了黃萎病菌V991 接種鑒定,結(jié)果表明:與野生型(WT)相比,超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因系對(duì)黃萎病菌V991 抗性減弱,出現(xiàn)典型的黃萎病癥狀,如葉片黃化、萎蔫脫落等(圖6c), 相應(yīng)的病情指數(shù)和發(fā)病率也支持該結(jié)果(圖6d)。此外,剖稈鑒定和真菌恢復(fù)培養(yǎng)的結(jié)果與表型結(jié)果相符(圖6e、f)。 以上結(jié)果表明, 超表達(dá)Gh-MYB43 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)黃萎病菌的敏感性增強(qiáng)。

    圖2 GhMYB43 同源蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和同源蛋白質(zhì)多重序列比對(duì)Fig. 2 Phylogenetic tree and multiple sequence alignment homologous proteins of GhMYB43

    圖3 GhMYB43 組織誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄模式分析Fig. 3 Tissue expression patterns and induced expression patterns of GhMYB43 analyzed by RT-qPCR

    為了進(jìn)一步鑒定GhMYB43 在棉花響應(yīng)黃萎病菌侵染中的功能, 構(gòu)建了GhMYB43 的VIGS 載體, 通過(guò)特異干涉棉花中GhMYB43 基因的表達(dá)考察棉花植株對(duì)病原菌抗性的變化。 棉花CLA 基因參與葉綠素的形成,VIGS 抑制CLA的表達(dá)后會(huì)造成棉花植株葉片白化(圖7a),因此可作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)RT-qPCR 分析,與TRV∷00對(duì)照相比,TRV∷GhMYB43 植株的GhMYB43轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(圖7b),黃萎病癥狀較輕(圖7c)。 從發(fā)病率和病情指數(shù)可以看出,TRV∷Gh-MYB43 植株發(fā)病率明顯低于TRV∷00 植株(圖7d);剖稈鑒定和真菌恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果也與表型結(jié)果相符(圖7e、f)。以上結(jié)果表明,抑制GhMYB43 轉(zhuǎn)錄會(huì)增強(qiáng)棉花植株對(duì)黃萎病菌的抗性。

    圖4 GhMYB43 亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GhMYB43

    圖5 GhMYB43 棉花原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄激活活性的分析Fig. 5 Transcriptional activity assay of GhMYB43 in cotton protoplasts

    2.6 GhMYB43 是木質(zhì)素合成中的負(fù)調(diào)節(jié)因子

    在前期研究中,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素代謝在棉花抵御黃萎病菌入侵的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21]。 而多有文獻(xiàn)報(bào)道, 木質(zhì)素代謝主要由NAC、MYB 等其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。 據(jù)此筆者猜測(cè)GhMYB43 可能也參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成通路[24-26]。 因此,首先對(duì)超表達(dá)GhMYB43 轉(zhuǎn)基因材料和對(duì)照材料(WT)中的木質(zhì)素進(jìn)行了組織化學(xué)染色和含量測(cè)定。從結(jié)果可以看出,無(wú)論水處理或V991 接種處理,轉(zhuǎn)Gh MYB43 基因材料的染色程度均低于野生型材料(圖8a), 表明轉(zhuǎn)GhMYB43 基因材料的木質(zhì)素積累低于對(duì)照材料。且木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果與染色結(jié)果相符,超表達(dá)GhMYB43 轉(zhuǎn)基因材料的木質(zhì)素含量明顯低于對(duì)照材料(圖8b)。

    圖6 超表達(dá)GhMYB43 抑制了轉(zhuǎn)基因材料對(duì)黃萎病菌的抗性Fig. 6 Overexpressing of GhMYB43 impair cotton resistance to Verticillium dahliae

    圖7 VIGS 抑制棉花GhMYB43 的表達(dá)情況及其對(duì)黃萎病菌的抗性鑒定結(jié)果Fig. 7 VIGS inhibition of the expression of GhMYB43 in cotton and its resistance to Verticillium dahliae

    圖8 超表達(dá)GhMYB43 棉花的木質(zhì)素含量情況Fig. 8 Lignin content of cotton overexpressing GhMYB43

    為了探索GhMYB43 在木質(zhì)素代謝中的功能,分析了木質(zhì)素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 在水處理?xiàng)l件下, 與WT 植株相比, 超表達(dá)Gh-MYB43 株系中的GhHCT-1、GhCCoAOMT-3 基因的轉(zhuǎn)錄水平降低(圖9a)。 同時(shí),在V991 處理下,超表達(dá)GhMYB43 株系中的GhHCT-1、GhCCoAOMT-3 基因的轉(zhuǎn)錄水平也比WT 植株的低(圖9b)。 還檢測(cè)了TRV∷GhMYB43 和TRV∷00幼苗中這類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是水處理還是接種V991 處理, 與TRV∷00 幼苗相比,TRV ∷GhMYB43 幼 苗 中 GhHCT-1、GhCCoAOMT-1 和GhCOMT-2 的轉(zhuǎn)錄水平均較高(圖9c、d)。 這些結(jié)果表明,GhMYB43 在木質(zhì)素合成中充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)因子。

    圖9 GhMYB43 負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 9 GhMYB43 negatively regulates the expression level of genes involved in lignin synthesis

    2.7 GhMYB43 負(fù)調(diào)控JA 信號(hào)通路

    JA 在棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性中起重要作用。 基于病原從根部侵染棉花的考慮,分析了接種后根部JA 信號(hào)通路基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明,在水處理(Mock)和V991 處理下,超表達(dá)GhMYB43 顯著降低了JA 代謝和信號(hào)通路基因 的 轉(zhuǎn) 錄 水 平, 例 如GhLOX4-1、GhLOX6-1、GhAOS1 和GhAOC3(圖10a)。 相反,VIGS 抑制GhMYB43 的表達(dá)后,JA 代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá)水平在接種V991 和Mock 處理中都 上 調(diào), 并 且 在 接 菌 后,GhLOX4-1、GhAOS1、GhAOC3 的表達(dá)顯著上調(diào)(圖10b)。 這些結(jié)果表明,GhMYB43 是JA 信號(hào)通路中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。

    圖10 GhMYB43 負(fù)調(diào)控JA 激素合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 10 GhMYB43 negatively regulates the expression level of genes involved in JA synthesis

    3 討論

    植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠多糖以及少量結(jié)構(gòu)蛋白組成, 是1 種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu), 通常決定植物與病原體之間相互作用的結(jié)果[27-28]。 木質(zhì)素代謝在植物病害和棉花對(duì)大麗輪枝菌抗性中發(fā)揮積極作用。 細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量越高,植物抗病性越強(qiáng)[22,28]。 GhLAC15 的過(guò)表達(dá)顯著提高了擬南芥的木質(zhì)素含量,從而提高了擬南芥對(duì)黃萎病的抗性[7]。 GhLac1 的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)化程度增加,與增強(qiáng)對(duì)真菌V. dahliae的耐受性相關(guān)[23]。 本研究發(fā)現(xiàn), 棉花接種V.dahliae 后木質(zhì)素合成相關(guān)基因和木質(zhì)素含量顯著增加。 研究還發(fā)現(xiàn),在抑制木質(zhì)素代謝之后,棉花黃萎病發(fā)生加重。 然而,最近的研究表明,降低次生細(xì)胞壁的木質(zhì)素含量會(huì)產(chǎn)生損傷相關(guān)分子模式(Damage-associatedmolecularpattern,DAMP),并可能誘導(dǎo)免疫激活[29]。因此,木質(zhì)素代謝與免疫激活的關(guān)系還比較復(fù)雜。 以往的研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄因子有多種, 如AtMYB15、PtoMYB156、OsSND2、GhUMC1、MYB20、MYB42、MYB43、MYB85、LTF1、GhFSN5、CmMYB8、GbERF1-like[6,9,24-26,30-32]。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn)GhMYB43也是1 種木質(zhì)素代謝調(diào)節(jié)因子。 對(duì)木質(zhì)素含量及相關(guān)基因表達(dá)的分析表明,GhMYB43 是木質(zhì)素代謝的負(fù)調(diào)節(jié)因子,但GhMYB43 與其他調(diào)節(jié)因子的相互作用及具體作用方式尚不清楚。

    JA 合成及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗黃萎病中起著重要作用[33]。 已經(jīng)鑒定了調(diào)節(jié)JA 合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的幾個(gè)關(guān)鍵基因。CPK33 通過(guò)促進(jìn)茉莉酸合成酶基因OPR3 的降解來(lái)減少JA 的積累,從而削弱抗病性[34]。 GbWRKY1 通過(guò)激活JAZ1 表達(dá)來(lái)減弱JA 信號(hào),因此起負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用[10]。 本研究發(fā)現(xiàn)GhMYB43 可以調(diào)節(jié)JA 合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。 參與JA 合成調(diào)控的基因在超表達(dá)GhMYB43 株系中下調(diào)表達(dá)。 同時(shí),當(dāng)GhMYB43 轉(zhuǎn)錄被抑制時(shí), 棉花中JA 合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào), 表明Gh-MYB43 對(duì)JA 合成有負(fù)調(diào)控作用。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 此外,JA 的合成和代謝可能與木質(zhì)素合成代謝有關(guān)。 JA 合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)的變化可以引起木質(zhì)素代謝的變化,同時(shí)木質(zhì)素代謝的變化也可以引起JA 合成或代謝的變化[35-36]。這表明JA 合成與木質(zhì)素合成之間的相互作用有多種調(diào)控途徑。 本研究發(fā)現(xiàn),Gh-MYB43 可以同時(shí)調(diào)節(jié)JA 的合成和木質(zhì)素的合成, 但GhMYB43 是否能調(diào)節(jié)JA 引起的木質(zhì)素合成尚需進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    在本實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上, 從陸地棉Jin668 中克隆了1 個(gè)R2R3 類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因。 氨基酸序列分析顯示,該基因編碼的蛋白含有2 個(gè)MYB 結(jié)構(gòu)域, 且與擬南芥的AtMYB43具有較高的相似性; 因此, 將其命名為Gh-MYB43。 GhMYB43 位于陸地棉D(zhuǎn)t 亞組第12 號(hào)染色體上, 編碼1 個(gè)含376 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),具有2 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子。RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)GhMYB43 在莖中優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄,受SA 和H2O2誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),而受Me-JA 誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá),且轉(zhuǎn)錄水平會(huì)受V.dahliae 誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,GhMYB43 蛋白定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。 抗病性鑒定發(fā)現(xiàn),抑制GhMYB43 轉(zhuǎn)錄會(huì)增強(qiáng)棉花植株對(duì)黃萎病菌的抗性, 超表達(dá)Gh-MYB43 增強(qiáng)了棉花對(duì)黃萎病菌的敏感性。RT-qPCR 結(jié)果、木質(zhì)素組織化學(xué)染色和含量測(cè)定結(jié)果表明,GhMYB43 負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成和JA 信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

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