液體活檢在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用進展

李恒震 張艷橋

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)作為全球第三大常見癌癥，每年會導(dǎo)致約80萬人的死亡，嚴重威脅著人類健康[1]。近年來，隨著環(huán)境等因素的影響，我國CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升及年輕化的趨勢。局限期CRC患者(Ⅰ期和Ⅱ期)5年生存率接近90%，而伴有遠處器官轉(zhuǎn)移的晚期CRC患者生存率僅為13.1%[2]，而且CRC起病隱匿，約1/4的患者在首次確診時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[3]，在這個階段，只能選擇姑息性治療，生活質(zhì)量較差且預(yù)后不良，治療相關(guān)的經(jīng)濟負擔也顯著增加。因此，實現(xiàn)CRC的早期診斷在疾病診療體系中具有重要地位，有助于疾病的早期干預(yù)和治療，可以顯著改善患者預(yù)后，降低死亡率。

針對CRC人群，目前臨床常用的篩查手段主要是腸鏡檢查、糞便隱血試驗、腫瘤標志物檢測和影像學檢查等。腸鏡檢查可以直接觀察腫瘤的位置及形態(tài)，獲取病變組織進一步行病理學檢查，是目前確診CRC的金標準，但是其存在有創(chuàng)性、受術(shù)者操作水平的影響，在臨床應(yīng)用過程中仍存在一定局限性。糞便隱血試驗及腫瘤標志物對CRC的診斷缺乏敏感性和特異性，而影像學檢查對微小殘留病灶和隱匿性轉(zhuǎn)移瘤難以識別。由此，液體活檢應(yīng)運而生并有望彌補這些檢查的不足。液體活檢是通過對生物源液體(通常是血液)特定成分進行分析，用于癌癥診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后評估的一種無創(chuàng)活檢組織檢查技術(shù)。液體活檢操作方便，可多次重復(fù)取樣，動態(tài)反映疾病變化，避免了腫瘤組織活檢的有創(chuàng)性、花費高、結(jié)果回報時間長等缺點，一定程度上可以克服腫瘤異質(zhì)性，更加全面反映患者疾病狀態(tài)，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，生物源液體特定成分主要包括循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、細胞游離DNA(Cell-free DNA，cfDNA)、外泌體(Exosomes，Exs)、腫瘤相關(guān)血小板(Tumor-educated platelets，TEPs)及循環(huán)腫瘤相關(guān)微粒(Tumor-associated microparticles，taMPs)等。本文就上述幾種生物源液體特定成分在CRC臨床診斷中的應(yīng)用進行綜述，為完善CRC患者的臨床診斷提供新思路。

1 CTCs

CTCs是從原發(fā)腫瘤病灶中分離出來的腫瘤細胞群，可以游離在患者的外周血中。CTCs主要通過血管內(nèi)活化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)或原發(fā)腫瘤的被動脫落而產(chǎn)生。根據(jù)上皮細胞和間質(zhì)標志物的表達差異，CTCs主要分為三種類型：上皮細胞表型、間質(zhì)細胞表型和混合表型。腫瘤細胞發(fā)生EMT后，細胞粘附分子表達減少，獲得間充質(zhì)細胞表型，增強細胞的運動能力，從而促進腫瘤細胞的侵襲和播散，導(dǎo)致腫瘤的早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此CTCs間質(zhì)細胞表型的出現(xiàn)意味著患者預(yù)后較差。目前CellSearchTM是FDA批準的唯一一種用于CTCs富集的技術(shù)，具有較高的特異性，在早期CRC患者中即可以檢測到CTCs的存在。因此，循環(huán)系統(tǒng)中CTCs的檢測有望成為CRC篩查的指標。

Wan等[4]通過分析438例腸鏡確診的CRC患者，其中111例為癌前病變，發(fā)現(xiàn)CTCs檢測對癌前病變的診斷敏感性和特異性分別為76.6%和97.3%，327例為CRC，CTCs檢測診斷的敏感性和特異性分別為86.9%和97.3%。最新研究表明CTCs檢出率與CRC患者分期密切相關(guān)[5]，Ⅰ～Ⅳ期檢出率分別為81.7%、82.4%、91.6%、93.4%，由此可見隨著病情的進展，CTCs的檢出率會顯著增高。與CRC診斷標準臨床方案相比，CTCs對包括癌前病變在內(nèi)的所有CRC疾病階段的總體診斷準確率為88%，健康對照組的假陽性率為3.3%，癌癥患者的假陰性率為16%。由此可見，CTCs檢測在CRC的診斷方面是一種潛在的、可行的新措施。此外，隨著靶向治療的興起，伴隨診斷作為一種新興的體外診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展。伴隨診斷通過評估患者特定生物標記物的表達水平，進而評價靶向藥物的治療效果，對患者選擇最佳靶向治療藥物具有重要意義。徐建明團隊[6]的一項研究入選了36例接受了PD1單抗(IBI308)治療的不同類型消化道腫瘤患者，通過對外周血CTCs進行分析，發(fā)現(xiàn)PDL1高表達(PDL1+++)的CTCs數(shù)目可以預(yù)測PD1治療效果，而且這類細胞比例越高，響應(yīng)率也越高，因此PDL1+++CTCs高的患者也具有更好的預(yù)后。

2 cfDNA和ctDNA

cfDNA是正常細胞、腫瘤細胞以及循環(huán)腫瘤細胞等發(fā)生凋亡或壞死后釋放到血液中的游離DNA片段，不僅存在于腫瘤患者體內(nèi)，也可以在健康人群的血液中檢測到。cfDNA一旦進入外周循環(huán)，半衰期很短，很快就會通過腎臟、肝臟和脾臟從體內(nèi)清除[7]。因此，cfDNA可以實時反映機體全身情況。其中腫瘤來源的DNA被稱為ctDNA，主要通過腫瘤細胞凋亡、壞死、CTCs溶解和腫瘤細胞外的活性分泌進入循環(huán)[8]?？梢源嬖谟诨颊叩难骸⒒ひ汉湍X脊液等液體中，經(jīng)尿液和糞便排出。通過測量等位基因突變片段可以獲得定量信息，可用于腫瘤診斷并反映腫瘤負荷情況[9]。此外，ctDNA在檢測微小殘留病灶和隱匿性轉(zhuǎn)移瘤以及監(jiān)測治療效果等方面均得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。

Luo等[12]通過前瞻性隊列研究驗證cfDNA在篩查CRC和高危人群方面的應(yīng)用價值。該研究共納入801例CRC患者和1 021例正常對照組的cfDNA樣本，通過統(tǒng)計方法，以選定的甲基化標志物構(gòu)建CRC診斷和預(yù)測模型，對CRC診斷的敏感性和特異性分別為89.9%和87.5%。預(yù)后模型可以有效預(yù)測CRC患者的預(yù)后和生存期(P<0.001)。同時還發(fā)現(xiàn)了一個單獨的ctDNA甲基化標志物cg10673833，在診斷CRC和癌前病變時具有高敏感性(89.7%)和特異性(86.8%)。Wan等[13]通過cfDNA全基因組測序建立分類模型對局限期(Ⅰ，Ⅱ期)CRC診斷的AUC值為0.92(95%CI：0.91～0.93)，敏感性和特異性均為85%。Church等[14]對53例CRC患者和1 457例健康志愿者外周血ctDNA基因甲基化水平進行分析發(fā)現(xiàn)，血漿SEPT9基因甲基化異常診斷CRC的敏感性為48.2%，特異性為91.5%；對CRC Ⅰ～Ⅳ期診斷敏感性分別為35.0%、63.0%、46.0%和77.4%，但對晚期腺瘤的診斷敏感性較低(11.2%)。因此，CRC人群篩查試驗大規(guī)模應(yīng)用于臨床還需要提高對早期癌癥和晚期腺瘤診斷的敏感性。

3 Exs

Exs是一種細胞通過胞吐方式分泌至微環(huán)境中的囊泡，直徑為40～100 nm，具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。人體中幾乎所有類型的細胞均可通過內(nèi)分泌或旁分泌的方式釋放Exs。因此Exs廣泛存在于血漿、唾液、尿液、母乳、羊水、腦脊液等多種體液中[15]。Exs通過其攜帶的微小RNA(micro RNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、DNA以及蛋白質(zhì)等生物活性成分的運輸，在細胞間物質(zhì)交換和信息交流中發(fā)揮重要作用。與正常細胞相比，腫瘤細胞分泌更多的外泌體，而且患者循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體與腫瘤細胞釋放的外泌體具有相似的遺傳信息，表明通過對Exs中遺傳信息的檢測有望成為腫瘤早期篩查的標記物。

與cfDNA相比，Exs攜帶的基因片段更加豐富而穩(wěn)定，因此在近幾年受到廣泛關(guān)注。CRC患者Exs中特異性miRNA的異常表達是早期診斷和分期評估的可靠生物標志物。Ogata-Kawata等[16]篩選并鑒定了16個可作為CRC生物標志物的外泌體miRNA，其中miR-1246和miR-23a的敏感性最高，可以達到95%和92%。miR-92a-3p和miR-17-5p診斷CRC患者的AUC達到0.845和0.897[17]。除了能將CRC患者與健康人進行區(qū)分，外泌體miRNA還可以區(qū)分出轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移患者。與非轉(zhuǎn)移性患者相比，轉(zhuǎn)移性患者外泌體中miR-1229和miR-25-3p，miR-17-5p和miR-92a-3p表達量更高，鑒別的AUC可以達到0.841，0.854[17-18]。此外Uratani等[19]發(fā)現(xiàn)與健康人相比，腺瘤患者的外泌體中miR-29a和miR-21水平升高，特別是外泌體miR-21的AUC值達到了0.77，敏感性為69.8%，特異性為80.0%。其表達水平與息肉的大小和數(shù)量也表現(xiàn)出了相關(guān)性。此外，Exs中其他非編碼RNA即lncRNA和circRNA也被證明與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Barbagallo等[20]檢測了CRC患者Exs中17個lncRNA和31個circRNA，驗證了其中1個上調(diào)表達的lncRNA：UCA1，下調(diào)表達的lncRNA：TUG1，以及上調(diào)表達的circHIPK3。發(fā)現(xiàn)circHIPK3和UCA1聯(lián)合診斷的AUC為0.814，敏感性為93%，特異性為64%，TUG1和UCA1聯(lián)合診斷的AUC為0.9，敏感性為100%，特異性為70%。外泌體中含有的大量核酸、蛋白質(zhì)等均在CRC患者中顯示出了明顯特異性，但目前的研究只是冰山一角，需要更多的研究來明確外泌體應(yīng)用于CRC診斷和預(yù)后的可行性，是非常值得深入研究的領(lǐng)域。

4 TEPs

血小板是從骨髓成熟的巨核細胞胞漿脫落下來的小塊胞質(zhì)，在外周血中含量豐富，主要發(fā)揮止血作用。最近研究表明，血小板可以促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并且腫瘤患者血小板反應(yīng)性較高，容易被激活，從而顯著增加了血栓的風險[21-23]。血小板通過攝取腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境釋放的外泌體，在血小板中發(fā)生剪切轉(zhuǎn)化為TEPs。因此TEPs也攜帶豐富的核酸和蛋白質(zhì)，包括mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等，具有豐富的表達譜。腫瘤患者TEPs表型和功能上的差異增加了它們作為腫瘤標志物的可能性[24-25]。TEPs作為一種新興的液體活檢技術(shù)，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。

Best等[26]通過對283份來自不同癌種患者和健康受試者的血小板mRNA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在癌癥患者中TEPs內(nèi)RNA譜發(fā)生改變，通過分析RNA譜的基因變化，可以區(qū)分228例局限性或者轉(zhuǎn)移性腫瘤及健康體檢者，準確率高達96%。不僅如此，TEPs還能區(qū)分并定位6種不同的腫瘤類型，其判斷原發(fā)腫瘤位置的準確率達71%。Yang等[27]通過分析44例CRC患者和55例健康患者的血小板RNA，發(fā)現(xiàn)了1 099個表達異常的基因，其中824個上調(diào)基因，275個下調(diào)基因。其中TIMP1的差異尤其明顯，CRC患者血小板中TIMP1 RNA水平明顯高于健康人或者炎癥性腸病患者，研究發(fā)現(xiàn)血小板中的TIMP1 RNA可以通過血小板傳遞進入腫瘤細胞中，在腫瘤細胞中被翻譯成有功能的蛋白質(zhì)，從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。因此，TIMP1 RNA有望作為診斷CRC的新型生物標志物。研究表明無誘因靜脈血栓栓塞患者具有較高的腫瘤發(fā)生風險，1年內(nèi)被診斷為腫瘤的概率為4%～7%[28]，而其中30%～60%的患者會因不及時的腫瘤篩查而延誤診斷和治療。針對這類特殊的患者，一項臨床研究(NCT02739867)正在進行中，通過檢測無誘因靜脈血栓栓塞患者血小板的RNA圖譜變化，探究TEPs中特定類型的基因?qū)@部分人群進行腫瘤篩查的準確性，這也進一步顯示了TEPs在腫瘤診斷領(lǐng)域的巨大潛力。

5 taMPs

細胞微粒(Microparticles，MPs)是細胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)的一種，直徑在100～1 000 nm之間，是活化或凋亡的細胞以及靜止的腫瘤細胞產(chǎn)生的囊泡，通過質(zhì)膜直接釋放至細胞外。在細胞活化或凋亡時，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，凝溶膠蛋白酶、鈣蛋白酶被激活分裂細胞骨架。同時激活磷脂雙向轉(zhuǎn)運酶，抑制氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺從細胞膜外層到細胞膜內(nèi)部的運輸平衡被破壞，從而使膜內(nèi)磷脂發(fā)生不對稱缺失。這些細胞骨架和膜表面的變化導(dǎo)致細胞以出芽方式產(chǎn)生MPs[29]。腫瘤細胞通過釋放taMPs影響組織因子和表面的磷脂酰絲氨酸的表達，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤相關(guān)凝血活動[30-32]。但是檢測taMPs需要排除EVs其他成分的影響，包括Exs和凋亡小體等，技術(shù)要求較高。

Willms等[33]通過對taMPs研究發(fā)現(xiàn)這是一種具有巨大潛力的生物標志物。研究納入了52例CRC、40例非小細胞肺癌和11例胰腺癌患者與作為陰性對照組的55例健康受試者和43例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的血清進行流式細胞學分析，離心分離后對taMPs上的抗原CD147和上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)進行定量分析。結(jié)果表明EpCAM在這些實體腫瘤中的總體陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為79.03%和85.29%，總體敏感性為95.15%，特異性為52.73%。EpCAM、CD147聯(lián)合檢測的總體陽性預(yù)測值略高：陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為80.36%和83.87%，總體敏感性為94.74%，特異性為54.17%，CD147作為單獨診斷指標效果較差。在CRC中，EpCAM+CD147+ taMPs與腫瘤體積表現(xiàn)出明顯相關(guān)性，同時根治術(shù)后，EpCAM+ taMPs明顯下降，也提示與腫瘤存在密切相關(guān)。因此EpCAM+CD147+taMPs以其在腫瘤診斷中較高的敏感性和特異性以及在評估腫瘤負荷和腫瘤治療效果的良好表現(xiàn)，在未來可能成為液體活檢中的重要檢查工具。

6 小結(jié)與展望

腫瘤發(fā)生是以致癌基因與抑癌基因平衡破壞為特點的多種因素共同作用的結(jié)果，通過液體活檢識別腫瘤患者所具有特異性標志物，實現(xiàn)對CRC患者的早期、無創(chuàng)診斷，可以改善患者預(yù)后降低死亡率。通過對腺瘤等癌前病變篩查及早進行干預(yù)可以明顯降低CRC發(fā)生率。通過伴隨診斷為患者選擇合適靶向藥物實現(xiàn)個體化精準治療。此外液體活檢可以實時監(jiān)測復(fù)發(fā)及治療反應(yīng)，更加全面評估患者預(yù)后。目前液體活檢的應(yīng)用還受到一些技術(shù)限制，以及許多成分還處于研究階段，但隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，一定會有越來越多的患者從中受益。