疫霉菌有性生殖檢測(cè)體系的建立

朱香園

（長(zhǎng)治市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，山西 長(zhǎng)治 046000）

疫霉菌屬于藻界（Chromista），卵菌門（Oomycota），鞭毛菌亞門（Mastigomycotina），卵菌綱（Ommycetes），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pyhiaceae），具有無(wú)性生殖和有性生殖兩種生殖方式[1]。馬鈴薯晚疫病就是該菌導(dǎo)致的，嚴(yán)重的可導(dǎo)致一個(gè)地區(qū)的馬鈴薯絕收[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌柱。本研究所用的馬鈴薯晚疫病菌—致病疫霉：BDTX5—1（A1）和HQK8—3（A2）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。黑麥—番茄培養(yǎng)基：900ml黑麥汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，瓊脂粉15g；燕麥—番茄培養(yǎng)基：900ml燕麥汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，瓊脂粉15g；以上培養(yǎng)基均是在121℃高壓下滅菌15min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的選擇。同時(shí)制備燕麥—番茄培養(yǎng)基和黑麥—番茄培養(yǎng)基平板，然后將同一種菌種在同一時(shí)間點(diǎn)分別接種在這兩種培養(yǎng)基平板上，放于18℃的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)，第三天的時(shí)候開始觀察不同培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)。并拍照。

1.2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株間卵孢子的產(chǎn)生。首先制備黑麥—番茄平板（9cm的培養(yǎng)皿）。分別將A1交配型和A2交配型的菌絲塊5mm×5mm×3mm，同時(shí)接種到同一平板上，兩個(gè)菌絲塊距平板中心約1.5cm，待兩個(gè)交配型的菌絲長(zhǎng)的剛接觸到時(shí)在顯微鏡下觀察是否有卵孢子產(chǎn)生。

1.2.3 致病疫霉紙盤法有性生殖檢測(cè)體系的建立。①制備1000ml 1970 V8 黑麥培養(yǎng)液分裝到2個(gè)三角瓶中，每瓶500mL，121℃高壓滅菌15min后，冷卻至室溫。②將A1交配型的14塊5mm×5mm×3mm菌絲塊和A2交配型菌絲塊1塊接種到500mL的培養(yǎng)液里，黑暗培養(yǎng)17d（20℃，80rpm）。作為實(shí)驗(yàn)組。③對(duì)照組的設(shè)置，將15塊5mm×5mm×3mm 的A2交配型菌絲塊接種到另一500ml的培養(yǎng)液里。以和實(shí)驗(yàn)組同樣的條件進(jìn)行培養(yǎng)。④17d后用定性濾紙將培養(yǎng)液中的菌絲體濾出，取出5 mL濾液過(guò)濾除菌后冷凍保存。其他培養(yǎng)液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮到5～10ml。將以上所得的慮液在置于冷凍干燥器中，進(jìn)行冷凍干燥將最終得到粉末稱重。⑤用10 mL無(wú)菌水將得到的A1和A2兩個(gè)交配型粉末分別溶解，然后進(jìn)行過(guò)濾除菌后分裝凍存。⑥將一塊A2交配型的5×5×3mm菌絲塊置于培養(yǎng)基中央（9cm的培養(yǎng)皿），18℃黑暗培養(yǎng)約10d。將第5步所得的液體滴在無(wú)菌濾紙片（Ф7mm）上，將濾紙片放于距培養(yǎng)皿中心約1.5cm的位置處（此時(shí)疫霉菌克隆的直徑約為40mm）培養(yǎng)7d，顯微鏡下觀察濾紙片覆蓋部位的卵孢子并計(jì)數(shù)。一個(gè)培養(yǎng)皿上可以放置6個(gè)濾紙片，設(shè)計(jì)成濃度梯度。其中一個(gè)是A2的濃縮培養(yǎng)液50μL，另外5個(gè)是A1的：一個(gè)為A1的最初培養(yǎng)液，其它四個(gè)為A1培養(yǎng)液濃縮后的液體，一個(gè)為濃縮液50μL，一個(gè)30 μL，一個(gè)20μL，一個(gè)10μL，不足50μL的體系用空白培養(yǎng)液補(bǔ)平）。該實(shí)驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。⑦濾紙片放好后，在18℃黑暗條件下培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察濾紙片覆蓋部位的卵孢子并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉培養(yǎng)基的選擇

以致病疫霉A2交配型菌株為代表，篩選適合的培養(yǎng)基。將A2交配型菌株分別接種在黑麥—番茄和燕麥—番茄培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況。燕麥—番茄培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的A2交配型菌落要比黑麥—番茄上的小。因此，黑麥—番茄培養(yǎng)基應(yīng)該更適合致病疫霉的生長(zhǎng)。

2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株間卵孢子的產(chǎn)生

分別把A1和A2交配型菌株接種在同一塊培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)天，顯微鏡觀察交界面處卵孢子的產(chǎn)生情況。這兩株致病疫霉菌株可以通過(guò)菌株間的有性生殖產(chǎn)生卵孢子，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 致病疫霉紙盤法有性生殖檢測(cè)體系的建立

三個(gè)重復(fù)中蘸有50 μL的A2濃縮培養(yǎng)液的濾紙片處均未產(chǎn)生卵孢子。同時(shí)也可以明顯看到隨著A1培養(yǎng)液濃度的增大，三個(gè)重復(fù)中每個(gè)濾紙片處的卵孢子數(shù)目也隨著增加。說(shuō)明A1濃縮培養(yǎng)液中含有α1性激素，且其含量能夠誘導(dǎo)A2交配型菌株產(chǎn)生合適數(shù)量的卵孢子，可以用于未來(lái)的有性生殖檢測(cè)。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究主要是對(duì)疫霉菌的有性生殖檢測(cè)體系進(jìn)行建立。結(jié)果表明，用濃縮的A1交配型菌株培養(yǎng)液可以有效誘導(dǎo)A2交配型菌株進(jìn)行有性生殖并產(chǎn)生合適數(shù)量的卵孢子，說(shuō)明紙盤法有性生殖檢測(cè)體系基本建立。

3.2 討論

A1和A2兩個(gè)交配型菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)都不能產(chǎn)生卵孢子，只會(huì)產(chǎn)生近梨形的孢子囊。當(dāng)將A1和A2兩個(gè)交配型菌株接種在同一培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)交配型菌株交界處有卵孢子產(chǎn)生，說(shuō)明兩個(gè)菌株間可以進(jìn)行有性生殖，本實(shí)驗(yàn)所用的A1和A2兩個(gè)交配型菌株可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

接下來(lái)我們嘗試?yán)脻饪s的疫霉菌培養(yǎng)液建立疫霉菌紙盤法有性生殖檢測(cè)體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同量的A1交配型菌株的濃縮培養(yǎng)液都會(huì)誘導(dǎo)A2交配型菌株產(chǎn)生卵孢子，只是隨著濃縮培養(yǎng)液的量的減少產(chǎn)生的卵孢子的數(shù)量也在減少。