咸蛋清蛋白酶解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

羅章 辜雪冬 張玉鳳 黃群

[摘要]本研究以咸蛋清蛋白酶解液為原料，將其與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析美拉德反應(yīng)進(jìn)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)最佳條件為葡萄糖添加量3.5%（w/v）、初始pH9.5、反應(yīng)溫度110℃、反應(yīng)時(shí)間60min。產(chǎn)物共檢測(cè)出61種揮發(fā)性成分，主要包括酚、羰基、酯、醇、烷烴及雜環(huán)化合物。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到60min時(shí)，產(chǎn)物中揮發(fā)性組分種類最多，風(fēng)味濃郁純正。羰基、芳香族及烯類化合物可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣形成有密切關(guān)聯(lián)，酸類物質(zhì)對(duì)美拉德產(chǎn)物香氣形成貢獻(xiàn)較小或參與不良風(fēng)味形成。

[關(guān)鍵詞]咸蛋清蛋白;美拉德反應(yīng);固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）;揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202009

咸蛋作為中國(guó)傳統(tǒng)美食，備受消費(fèi)者喜愛(ài)，但人們對(duì)咸蛋的利用往往集中在蛋黃部分，咸蛋的蛋黃因其特殊的風(fēng)味和口感，常被用來(lái)制作粽子、月餅等糕點(diǎn)[1]，而咸蛋清的價(jià)值并沒(méi)有得到充分的挖掘和利用。咸蛋清中含有卵白蛋白、伴白蛋白、卵球蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶6種主要蛋白質(zhì)，其生物價(jià)值高，極易被機(jī)體吸收利用[2]。目前的加工利用方式使得咸蛋清被作為廢物扔棄，既造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)，又對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[3]。采用生物酶解技術(shù)對(duì)動(dòng)、植物蛋白進(jìn)行酶解，以此來(lái)制備活性肽及游離氨基酸已成為綜合利用蛋白資源的重要手段[4]。

美拉德反應(yīng)又稱為非酶促褐變反應(yīng)、羰氨反應(yīng)，是指羰基化合物與氨基化合物之間經(jīng)過(guò)縮合、聚合最終生成類黑精的反應(yīng)[5]，廣泛存在于食品熱加工和貯藏過(guò)程中，可顯著影響食品的香氣、滋味、色澤、穩(wěn)定性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物（肽、游離氨基酸）是美拉德反應(yīng)的重要前體物，通過(guò)肽糖交聯(lián)等方式參與反應(yīng)[7]。目前主要以海鮮類（牡蠣，淡水魚(yú)，螃蟹等）、花生粕、大豆、小麥等[8-13]為蛋白質(zhì)原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)，而用咸蛋清蛋白酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道極少。

本研究以咸蛋清蛋白酶解液為原料與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分和褐變程度為指標(biāo)，對(duì)美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）分析美拉德反應(yīng)過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化，以此來(lái)研究反應(yīng)產(chǎn)物中香味的成分，并為咸蛋清的高效利用提供相應(yīng)的試驗(yàn)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

咸蛋：光陽(yáng)蛋業(yè);風(fēng)味蛋白酶：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;NaOH、HCl、葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司;SPME手動(dòng)進(jìn)樣裝置：美國(guó)Supelco公司;HH-S2型恒溫水浴鍋：金壇區(qū)成輝儀器廠;pHS-25型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA2004型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;LXJ-IIB型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司;722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 咸蛋清酶解液的制備工藝流程

取咸蛋清→過(guò)濾→稀釋（咸蛋清與去離子水的體積比為1∶5）→調(diào)節(jié)pH（1mol/L NaOH、HCl）→加熱預(yù)處理→加酶（風(fēng)味蛋白酶）[14]恒溫水浴酶解（7h，55℃）→滅酶（沸水浴，15min）→冷卻后離心 （4 500r/min，10min）→取上清液→制得咸蛋清蛋白酶解液。

1.3.2 咸蛋清酶解液美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物測(cè)定

取20mL上述制得的咸蛋清蛋白酶解液，調(diào)節(jié)pH（1mol/L NaOH、HCl），加入葡萄糖，使其發(fā)生美拉德反應(yīng)，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。

由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)后具有感官評(píng)價(jià)基礎(chǔ)的10名（5女，5男）食品專業(yè)學(xué)生組建感官評(píng)價(jià)小組，分別從氣味、滋味、外觀三個(gè)方面對(duì)美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物逐一評(píng)價(jià)打分，取其平均值作為最后評(píng)分結(jié)果。將美拉德反應(yīng)液稀釋50倍，以蒸餾水為參照，使用可見(jiàn)分光光度計(jì)在420nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值，以此測(cè)定美拉德反應(yīng)的褐變程度[15]。參照孫紅梅等[16]對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官要求，并做適當(dāng)?shù)男薷?，制作出美拉德反?yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1。

1.3.3 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化

分別研究美拉德反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、葡萄糖添加量和酶解液初始pH這四個(gè)單因素對(duì)美拉德反應(yīng)的影響。反應(yīng)時(shí)間分別取20min、40min、60min、80min、100min、120min;反應(yīng)溫度分別取90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃;葡萄糖添加量分別取0.5%（w/v）、1.5%（w/v）、2.5%（w/v）、3.5%（w/v）、4.5%（w/v）、5.5%（w/v）;酶解液初始pH分別取5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

利用單因素試驗(yàn)的最佳值，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定美拉德反應(yīng)的最優(yōu)工藝參數(shù)，并對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.4 SPME-GC-MS對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分析

固相微萃取條件：萃取纖維在GC進(jìn)樣口250℃老化20min，將5mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物裝入15mL萃取瓶，于80℃恒溫水浴鍋中平衡10min，然后將SPME進(jìn)樣器通過(guò)瓶蓋橡皮墊插入瓶中，推出纖維頭，吸附1h，隨即插入GC-MS進(jìn)樣口250℃解析5min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱，30m×0.25um×0.25mm，325℃;以高純He為載氣，流速為1.0mL/min。升溫程序：初始柱溫35℃，保持5min;以4℃/min升溫至210℃，保持5min;再以5℃/min升溫至220℃（不保持）;進(jìn)樣口溫度250℃。

MS條件：離子源溫度230℃，電離方式EI，電子能量70EV，掃描質(zhì)量范圍35～400amu。

利用計(jì)算機(jī)檢索NIST 11譜庫(kù)，比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，匹配樣品中各未知揮發(fā)性成分，選擇與色譜峰匹配度較高（≥80）的化合物，加以人工解析譜圖，采用峰面積歸一化法來(lái)確定美拉德反應(yīng)物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)溫度為110℃，酶解液初始pH為9.0，葡萄糖添加量為3.5%（w/v），考查反應(yīng)時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，A420呈現(xiàn)先急劇后變緩的增長(zhǎng)趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間為100min時(shí)，A420基本趨于平穩(wěn)狀態(tài)，其原因可能是美拉德反應(yīng)進(jìn)行到100min，此時(shí)該反應(yīng)已處于終止階段，褐變程度也達(dá)到最大值[17];隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，體系中水分大量損失，導(dǎo)致產(chǎn)物的濃度不斷增高[18]。反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí)，感官評(píng)分最高，而反應(yīng)時(shí)間達(dá)到100min后，則會(huì)呈現(xiàn)出令人不悅的深褐色及焦苦味，感官評(píng)分值明顯降低。綜合考慮，美拉德反應(yīng)時(shí)間為60min較合適。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)時(shí)間為60min，酶解液初始pH為9.0，葡萄糖添加量為3.5%（w/v），考查反應(yīng)溫度對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

溫度是影響美拉德反應(yīng)的重要因素之一，溫度升高會(huì)加速美拉德反應(yīng)，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的異味;溫度過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)程度不夠，香氣不夠濃郁[19-20]。因此合適的溫度對(duì)于美拉德反應(yīng)尤為重要。由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，其褐變程度逐漸增加。反應(yīng)溫度較低時(shí)，產(chǎn)物中蛋腥味較濃;溫度過(guò)高時(shí)，焦苦味較明顯;當(dāng)反應(yīng)溫度為110℃時(shí)，產(chǎn)物中香味最濃郁，感官評(píng)分最高。此結(jié)論與韓科研等[21]所報(bào)道的美拉德反應(yīng)的最佳溫度為115℃相接近。因此，綜合褐變程度及感官評(píng)分結(jié)果，將110℃設(shè)為美拉德反應(yīng)的適宜溫度。

2.1.3 葡萄糖添加量對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)溫度為110℃，反應(yīng)時(shí)間為60min，酶解液初始pH為9.0，考查葡萄糖添加量對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

葡萄糖是參與美拉德反應(yīng)最常見(jiàn)的還原糖之一，當(dāng)氨基酸添加量一定時(shí)，增加還原糖的用量有助于促進(jìn)美拉德反應(yīng)。由圖3可知，在低濃度范圍內(nèi)，隨著葡萄糖添加量的增加，反應(yīng)逐漸劇烈，其褐變程度增長(zhǎng)較快;但當(dāng)葡萄糖的添加量高于4.5%時(shí)，A420幾乎不變，其原因可能是反應(yīng)體系中氨基酸態(tài)氮消耗殆盡，美拉德反應(yīng)達(dá)到平衡[22]。隨著美拉德反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，具有香味的小分子物質(zhì)不斷形成，與此同時(shí)，這些小分子物質(zhì)又隨反應(yīng)程度的不斷加深環(huán)化成大分子物質(zhì)，使得香味維持動(dòng)態(tài)平衡甚至減弱[23]。因此，當(dāng)葡萄糖添加量超過(guò)3.5%后，反應(yīng)產(chǎn)物中的大分子物質(zhì)遮蓋了部分揮發(fā)性香味物質(zhì)，使得產(chǎn)物帶有焦糊苦味，感官評(píng)分值下降。綜上，選擇3.5%的葡萄糖添加量進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 酶解液初始pH對(duì)美拉德反應(yīng)的影響

控制反應(yīng)溫度為110℃，反應(yīng)時(shí)間為60min，葡萄糖添加量為3.5%（w/v），考查酶解液初始pH對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可知，隨著酶解液初始pH的增加，美拉德反應(yīng)的褐變程度先緩慢增長(zhǎng);當(dāng)pH>10.0時(shí)，其褐變程度急劇上升。其原因可能是，氨基在酸性條件下以-NH3+存在阻礙羰氨縮合，導(dǎo)致褐變程度不明顯;而在堿性條件下，氨基酸態(tài)氮被游離出來(lái)參與反應(yīng)，堿性越高，反應(yīng)越強(qiáng)烈[24]。當(dāng)pH>9.0時(shí)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其產(chǎn)物的顏色及香味物質(zhì)會(huì)受到不同程度的影響，感官評(píng)分逐漸降低。因此，綜合考慮，美拉德反應(yīng)的最適宜的酶解液初始pH為9.0。

2.2 美拉德反應(yīng)正交試驗(yàn)分析

以上述四個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，可得到正交因素水平（見(jiàn)表2），利用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響美拉德反應(yīng)的因素有B（初始pH）>C（反應(yīng)時(shí)間）>A（葡萄糖添加量）>D（反應(yīng)溫度），并得到美拉德反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為B3C2A2D2，即酶解液初始pH 9.5、反應(yīng)時(shí)間60min、葡萄糖添加量3.5%（w/v）、反應(yīng)溫度110℃。在該條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，感官評(píng)分值達(dá)到85，該分值是所有組合中最高的，此時(shí)測(cè)得A420為1.11，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香味濃郁，色澤誘人，說(shuō)明正交試驗(yàn)優(yōu)化所得結(jié)論較為合理。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)分析

美拉德反應(yīng)進(jìn)行到不同時(shí)間，其揮發(fā)性產(chǎn)物通過(guò)固相微萃取并經(jīng)GC-MS分析后，得到總離子流色譜圖見(jiàn)5～圖9，揮發(fā)性產(chǎn)物的種類及相對(duì)含量見(jiàn)表4。

由圖5～圖9及表4可知，在咸蛋清蛋白酶解液與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物中共檢測(cè)出61種揮發(fā)性物質(zhì)，主要有酚、羰基、酯、醇、烷烴及其他雜環(huán)化合物，還包括少量的烯、酸、醚類化合物。

反應(yīng)進(jìn)行到不同時(shí)間（20min、40min、60min、80min、100min），鑒定出的揮發(fā)性組分分別為30種、34種、41種、31種、26種，在60min時(shí)檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，產(chǎn)物風(fēng)味協(xié)調(diào)。因此，從揮發(fā)性成分的種類和相對(duì)含量來(lái)考慮，可以得出美拉德反應(yīng)適宜的時(shí)間為60min，此結(jié)果與感官評(píng)定的結(jié)論一致。

2.4 美拉德反應(yīng)過(guò)程中揮發(fā)性組分種類和含量分析

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)香機(jī)理極為復(fù)雜，其產(chǎn)物特征香味的形成可能與閾值較低的醇、醛、酮和酯等簡(jiǎn)單化合物及含硫、氧、氮原子等雜環(huán)化合物共同作用有關(guān)。美拉德反應(yīng)在不同時(shí)間段中揮發(fā)性產(chǎn)物的比較見(jiàn)圖10。由圖10可知，在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，羰基、酯類和酚類化合物的含量較高，烯類、醚類及酸類等含量較低，醇類和雜環(huán)類化合物的相對(duì)含量變化不大;羰基、芳香族及烯類化合物的相對(duì)含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在60min時(shí)其含量達(dá)到最高，此結(jié)果與感官評(píng)定香氣的變化趨勢(shì)一致，由此可以推測(cè)，羰基、芳香族及烯類化合物可能對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香氣的形成貢獻(xiàn)較大或與香氣的形成有密切關(guān)系。

在5個(gè)不同的時(shí)間段中均檢測(cè)出1，3-二甲基苯、甲氧基苯基肟、苯乙醛、苯乙酮、壬醛、正癸醛;反應(yīng)進(jìn)行到60min時(shí)，僅檢測(cè)到1-辛醇、4-甲基- 3-苯基-2（5H）-呋喃酮、4-苯基-3-丁烯-2-酮、樟腦。因此，上述所提及的揮發(fā)性物質(zhì)極有可能共同參與了咸蛋清蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的特征香氣的形成。而僅在100min時(shí)檢測(cè)出了酸類化合物，說(shuō)明十四酸或棕櫚油酸對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香氣的形成貢獻(xiàn)較小，或極可能參與了異味的形成。

3 結(jié) 論

將咸蛋清蛋白酶解液與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)條件行進(jìn)優(yōu)化，最終得到影響美拉德反應(yīng)的主要因素有B（初始pH）>C（反應(yīng)時(shí)間）>A（葡萄糖添加量）>D（反應(yīng)溫度），由此可以確定美拉德反應(yīng)最佳條件如下：初始pH 9.5、反應(yīng)時(shí)間60min、葡萄糖添加量3.5%（w/v）、反應(yīng)溫度110℃。在該條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，感官評(píng)分值達(dá)到85，該分值是所有組合中最高的，即優(yōu)化較為合理。

采用SPME-GC-MS分析美拉德反應(yīng)進(jìn)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，在其產(chǎn)物中共檢測(cè)出61種香氣組分，主要包括酚、羰基、酯、醇、烷烴及雜環(huán)化合物。反應(yīng)60min時(shí)揮發(fā)性組分種類最多，產(chǎn)物的風(fēng)味濃郁純正，此結(jié)果與感官評(píng)定香氣的變化趨勢(shì)一致。由此推測(cè)出，羰基、芳香族及烯類化合物可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣形成有密切關(guān)聯(lián)，酸類物質(zhì)對(duì)美拉德產(chǎn)物香氣的形成貢獻(xiàn)較小或參與不良風(fēng)味的形成。

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