豬圓環(huán)病毒抗原表位肽免疫層析試紙條的研制

楊禮

摘 ?要：豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）的感染與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的發(fā)生密切相關(guān)。為快速便捷地檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體，本次試驗(yàn)主要采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，運(yùn)用金黃色葡萄球菌蛋白A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）作為標(biāo)記蛋白制備金標(biāo)墊，分別以豬圓環(huán)病毒抗原表位肽和SPA免疫兔血清純化IgG作為檢測(cè)帶（T帶）與質(zhì)控帶（C帶），經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，分別確定了膠體金的最佳標(biāo)記濃度、最適pH、重懸液和樣品墊處理液的最佳配方以及檢測(cè)帶（優(yōu)勢(shì)抗原表位肽）和質(zhì)控帶（多抗IgG）的最適包被濃度，最終裝配成抗體檢測(cè)試紙條，用以檢測(cè)已知的PCV2陽性血清和陰性血清，驗(yàn)證其檢測(cè)的敏感性、特異性與穩(wěn)定性。結(jié)果表明，經(jīng)納米粒度儀檢測(cè)可得知膠體金顆粒大小在10 nm～14 nm之間。用SPA標(biāo)記膠體金的最適pH為6.0，最佳標(biāo)記量為7 μg/mL。檢測(cè)帶和質(zhì)控帶的蛋白包被濃度均為1 mg/mL。經(jīng)驗(yàn)證，該試紙條不同批次間以及同一批次內(nèi)重復(fù)性較好，具有較好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬血清樣品中的抗體水平，可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)豬圓環(huán)病毒病疫苗的免疫效果。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;豬圓環(huán)病毒抗原表位肽;免疫層析試紙

中圖分類號(hào)：S852.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2020）07-0022-06

1 ?材料和儀器

1.1 材料

PVC襯板、NC膜、玻璃纖維和吸水紙均購自GE公司;蔗糖、吐溫20、氯金酸和氯化鈉購自SIGMA公司;金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和海藻糖購自BD公司;純凈水購自娃哈哈公司;SPA免疫兔血清純化后的IgG和豬圓環(huán)病毒抗原表位肽由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器

4 ℃離心機(jī)和納米粒度儀均購自馬爾文（Malvern）公司，型號(hào)分別為MGLD4-2A和ZNE3600。

2 ?方法

2.1 膠體金顆粒的制備

2.1.1 玻璃器皿的清潔

玻璃表面少量的污染會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃器皿應(yīng)該絕對(duì)清潔，使用前經(jīng)過酸洗和硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液1 min，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。

2.1.2 膠體金溶膠制備

膠體金顆粒的直徑與制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的數(shù)量密切相關(guān)，保持其他條件恒定，只改變加入的檸檬酸三鈉的數(shù)量，可制得不同顏色的膠體金，也就是不同粒徑的膠體金（表1）。膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射性也隨之發(fā)生變異，有肉眼可見的顯著顏色變化。

在硅化后的錐形瓶中加入100 mL水，置于磁力攪拌器上加熱，同時(shí)加入1 mL 1%的氯金酸水溶液，加熱至沸，調(diào)整至一定轉(zhuǎn)速后邊攪拌邊逐滴加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸15 min;膠體金溶液的顏色由藍(lán)變紫，再由紫變紅，冷卻后用蒸餾水定容至初始體積，置4 ℃保存。

2.1.3 膠體金顆粒大小測(cè)量

取50 μL制備好的膠體金，放入納米粒度儀內(nèi)測(cè)定膠體金顆粒的大小。

2.2 金標(biāo)SPA（抗原）最佳標(biāo)記條件的確定

2.2.1 SPA最佳標(biāo)記量的確定

⑴將SPA溶解稀釋成0.2 mg/mL;

⑵取96孔板，每孔加入100 μL的膠體金;

⑶將1 μL～20 μL 0.2 mg/mL的SPA分別加入每孔并混勻，靜置15 min;

⑷每孔加入20 μL 10%NaCl溶液，放置10 min，顏色保持紅色的為最小蛋白用量，在此基礎(chǔ)上加20%為最佳標(biāo)記量。

2.2.2 SPA與膠體金最佳標(biāo)記pH確定

⑴取96孔板，每孔加入100 μL的膠體金;

⑵每孔加入已確定的SPA的最佳標(biāo)記量 ;

⑶每孔分別加入2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL和15 μL ? 的0.1 mol/L K2CO3并混勻，靜置15 min;

⑷每孔加入20 μL的10% NaCl溶液，放置10 min;

⑸顏色仍保持紅色的為最佳量，測(cè)定pH，即為SPA與膠體金的最佳標(biāo)記pH。

2.3 SPA-膠體金重懸液的制備

2.3.1 重懸液的配制

按下面的方法配制重懸液。

⑴取5 g蔗糖、0.121 g三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane，Tris）、500 μL吐溫20、2 g BSA、3%海藻糖和0.5% PVP，溶于100 mL雙蒸水中，過濾備用。

⑵取5 g蔗糖、0.121 g Tris、500 μL吐溫20和2 g BSA，溶于100 mL雙蒸水中，過濾備用。

2.3.2 SPA-膠體金重懸液量的確定

在1 mL膠體金溶液中按最佳標(biāo)記量加入SPA，加入一定體積的0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)至最佳pH，室溫下計(jì)時(shí)放置30 min，每隔5 min震蕩一次。加入5% BSA至終濃度為1%，室溫下計(jì)時(shí)放置20 min，每隔 ? ? ? 5 min震蕩一次;4 ℃，2 000 r/min離心10 min，棄沉淀;收集上清液，4 ℃， ?10 000 r/min離心30 min;離心后，上清無色透明最好（圖1）。小心吸去上清，將沉淀分別溶于100 μL、150 μL和200 μL的重懸液中，制成不同重懸液的標(biāo)記膠體金溶液。

2.4 樣品墊的預(yù)處理

⑴取0.6 g Tris、1 g吐溫20、1 g PVP和1 g BSA溶于100 mL水中，過濾備用。

⑵取20 mmol/L聚丁烯（Polybutylene，PB）、1%吐溫20、1% BSA和2.5%蔗糖溶于100 mL水中，過濾備用。

將玻璃纖維膜切成4 mm左右的樣品條，然后分別浸泡于兩種處理液中，室溫晾干或烘干。

2.5 金標(biāo)墊的制備

SPA-膠體金重懸液混勻后分別涂抹于未做任何處理的玻璃纖維紙條上，吸附比例為10 μL/cm～50 μL/cm。自然干燥或烘干（圖2）后避光保存。

2.6 豬圓環(huán)病毒抗原表位肽與兔抗SPA IgG濃度的確定

為建立質(zhì)控帶和檢測(cè)帶，將不同濃度豬圓環(huán)病毒的抗原表位肽與兔抗SPA IgG通過交叉試驗(yàn)（表2），分別以1 μL/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，制成試紙條，觀察顯色，測(cè)定兩者反應(yīng)的最佳濃度。

⑴純化后的豬圓環(huán)病毒抗原表位肽的包被濃度分別為0.5 mg/mL、0.8 mg/mL和 ?1 mg/mL;

⑵兔抗SPA IgG的包被濃度分別為 ?0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL;

2.7 豬圓環(huán)病毒抗原表位肽免疫層析試紙條的制備

在確定了膠體金的制備條件、標(biāo)記物最適濃度、檢測(cè)帶優(yōu)勢(shì)抗原表位肽濃度和質(zhì)控帶多抗IgG濃度的基礎(chǔ)上，制備豬圓環(huán)病毒抗原表位肽免疫層析試紙條。試紙條的構(gòu)造主要包括PVC襯板、NC膜、吸收墊、樣品墊、金標(biāo)墊、檢測(cè)帶和質(zhì)控帶（圖3）。具體制備過程如下：

⑴將優(yōu)勢(shì)抗原表位肽和兔抗SPA IgG用超純水稀釋為步驟2.6所測(cè)得的最佳濃度。按1 μL/cm的速度將兩種蛋白噴于硝酸纖維素膜上，分別形成檢測(cè)帶和質(zhì)控帶。

⑵在PVC底板上分別將預(yù)處理的玻璃纖維紙制成的樣品墊、檢測(cè)帶和質(zhì)控帶以及金標(biāo)墊和吸收墊按圖3裝配（各部分略有重疊即可）。以縱向剪切，裁成寬為4 mm的條狀成品，即為試紙條成品。

2.8 試紙條的檢測(cè)原理及結(jié)果判定

如果血液樣品中含有PCV2抗體，將該血清適度稀釋后加在本試紙條的樣品墊上，該液體隨后會(huì)沿著試紙條進(jìn)入金標(biāo)蛋白釋放墊中，血液樣品中含有的PCV2抗體與金標(biāo)墊上標(biāo)記膠體金的SPA結(jié)合形成相應(yīng)的復(fù)合物，前行與包被的PCV2優(yōu)勢(shì)抗原表位肽結(jié)合后形成紅色線條，即在檢測(cè)帶形成紅色條帶，繼續(xù)前行，未與抗原結(jié)合的抗體攜帶SPA與已包被的兔抗SPA IgG抗體形成紅色線條，即在質(zhì)控帶形成紅色條帶。如果質(zhì)控帶不出現(xiàn)紅色條帶，則說明該試紙條失效。如果被檢血液樣品中不含有PCV2相關(guān)抗體，則檢測(cè)帶不會(huì)出現(xiàn)紅色條帶，但質(zhì)控帶必定會(huì)出現(xiàn)紅色條帶。

2.9 血清樣品的稀釋度測(cè)定

將陰性血清和陽性血清倍比稀釋，在已確定的抗原最佳標(biāo)記量和最佳pH、質(zhì)控帶檢測(cè)線濃度、重懸液配方及用量以及樣品墊的預(yù)處理方式等條件下，制作免疫層析試紙條，分別取1∶100、1∶200、1∶500、1∶800、1∶1 000稀釋的陰性血清和陽性血清進(jìn)行檢測(cè)。

2.10 自制試紙條與市售成品試紙條的對(duì)比

將制好的試紙條與市售成品試紙條進(jìn)行效果比對(duì)。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 膠體金顆粒大小測(cè)定結(jié)果

膠體金顆粒大小測(cè)定結(jié)果如圖4及表3。

由圖4和表3可得：所制膠體金顆粒直徑大約在10 nm～14 nm之間，符合我們的要求。

3.2 標(biāo)記抗原的最佳標(biāo)記量和最佳pH

由圖5可得，第3孔仍保持紅色，即最小蛋白濃度為6 μg/mL，在該基礎(chǔ)上加20%，則SPA的最佳標(biāo)記量為7 μg/mL。

由試驗(yàn)可知，pH為6.0時(shí)，為最佳標(biāo)記pH。

3.3 重懸液的最適量

由試驗(yàn)可知，當(dāng)重懸液按照5 g蔗糖、0.121 g Tris、500 μL吐溫20、2 g BSA、3%海藻糖和0.5% PVP溶于100 mL雙蒸水的方法配制，加入量為200 μL時(shí)，效果最佳。效果如圖6。

3.4 豬圓環(huán)病毒抗原表位肽與兔抗SPA多抗IgG濃度

交叉試驗(yàn)表明抗原表位肽的包被濃度為1 mg/mL，多抗IgG的濃度為1 mg/mL時(shí)，效果最佳。

3.5 樣品墊的預(yù)處理

樣品墊按照標(biāo)題“2.4 樣品墊的預(yù)處理”中的“（2）取20 mmol/L聚丁烯（polybutylene，PB）、1.5 mL 1.0%吐溫20、1 mL 1.0% BSA和3 g 2.5%蔗糖溶于100 mL水中”配制處理后，效果良好。

3.6 待檢血清樣品的稀釋度測(cè)定

檢測(cè)結(jié)果表明，陰性血清和陽性血清在1∶100稀釋的條件下，試紙條顯色最強(qiáng)，顏色最鮮明，即檢測(cè)效果最好。

3.7 自制試紙條與市售成品試紙條的對(duì)比

將制成的試紙條裝入現(xiàn)成的盒子中，加入100 μL的1∶100稀釋的陽性血清，對(duì)比效果如圖7。

自制試紙條質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均顯色良好，幾種市售成品試紙條檢測(cè)帶顯色較淡或假陰性較強(qiáng)。故本試驗(yàn)所制試紙條檢測(cè)效果明顯相對(duì)較好。

4 ?討論

膠體金免疫層析技術(shù)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù)[6]。其原理為：將各種已知反應(yīng)試劑分點(diǎn)固定在層析試紙條上，檢測(cè)樣品加在試紙條的一端，使其通過毛細(xì)管作用在層析試紙條上泳動(dòng)，樣本中的檢測(cè)物與層析試紙條中的反應(yīng)試劑發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成的復(fù)合物被富集或固定在層析試紙條上的特定區(qū)域（檢測(cè)帶和質(zhì)控帶），通過標(biāo)記免疫技術(shù)顯色[7]。具有操作方便和不需要任何儀器、體積小、易于判斷、靈敏度高、特異性好以及速度快等特點(diǎn)[8]。如今該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物檢疫工作中，如豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征和豬細(xì)小病毒病等傳染病的病原微生物抗原和抗體檢測(cè)，也可用于一些違禁和超量使用激素殘留的檢測(cè)[9]。

目前，PCV2的診斷方法主要為PCR、免疫組化、原位雜交、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）和間接免疫熒光（IIF），這些方法主要用于檢測(cè)抗原。PCV2的抗體檢測(cè)主要手段為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等，ELISA包括競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA和抗原捕獲ELISA等。IIF和IPMA較為經(jīng)典，但對(duì)操作要求很高，不便于大量樣品的檢測(cè)，ELISA操作簡單可靠，特異性好，但需要借助昂貴的儀器[10]。

本次試驗(yàn)將兔抗SPA IgG和純化豬圓環(huán)病毒抗原表位肽作為質(zhì)控帶和檢測(cè)帶標(biāo)記于硝酸纖維素膜上，并與樣品墊、金標(biāo)墊和吸水紙組裝成免疫層析檢測(cè)試紙條。經(jīng)驗(yàn)證，該試紙條不同批次間和同一批次內(nèi)重復(fù)性較好，具有較好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬血清樣品中的抗體水平，可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)豬圓環(huán)病毒病疫苗的免疫效果。將自制試紙條與市售試紙條進(jìn)行對(duì)比較，自制試紙條的檢測(cè)結(jié)果明顯好于市售試紙條。

參考文獻(xiàn)：（10篇，略）