大蒜素對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制?

浦春寧 陳 驊△ 凌書建

（1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院，浙江 嘉興 314000；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000）

燒傷是一種因熱力如火、熱氣、熱液體等導(dǎo)致的人體組織器官損傷，包括電燒傷、化學(xué)品燒傷，發(fā)病率居外傷疾病譜第4位，每年僅因火燒傷致死患者超過(guò)30萬(wàn)，此外還有大量患者因燒傷致殘、致畸，給家庭和社會(huì)造成巨大危害[1]。按照“三度四分法”分級(jí)，燒傷深度可分為Ⅰ度、淺Ⅱ度、深Ⅱ度和Ⅲ度燒傷，其中深Ⅱ度燒傷臨床最為常見(jiàn)。皮膚是燒傷最易損傷的組織，創(chuàng)面組織恢復(fù)是燒傷治療的關(guān)鍵，若創(chuàng)面愈合不佳易形成瘢痕甚至繼發(fā)感染，危及生命。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基過(guò)度累積誘發(fā)創(chuàng)面組織水腫、炎癥反應(yīng)、阻滯修復(fù)細(xì)胞遷移和增殖等氧化應(yīng)激反應(yīng)是影響燒傷創(chuàng)面愈合的重要因素[2]。大蒜素是天然存在的一種二烯丙基三硫化物，具有良好的抗氧化活性[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以深Ⅱ度燒傷大鼠模型為研究對(duì)象，研究大蒜素對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響并探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 180只無(wú)病原微生物級(jí)雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量220～250 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004]；實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.2 試藥與儀器 大蒜素注射液購(gòu)自黑龍江江世藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20190326）；磺胺嘧啶銀軟膏購(gòu)自沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司（批號(hào)：181225）；乳酸鈉林格注射液購(gòu)自安徽雙鶴藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20190426）；羥脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限 公 司（ 批 號(hào) ：20190329、20190508、20190317、20190114）；兔抗鼠表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）、β-actin單克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：201904015、201905027、20190514）；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司（批號(hào)：EB190217）。YLS-5Q型燙傷儀（天津科技發(fā)展有限公司）；Allegra 21R型低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；UV2100型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；Muhiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Ameritech公司）；CUT 4050型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Tetra Systerm型垂直電泳槽、Power Pac Basic轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；CKX41型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實(shí)驗(yàn)，對(duì)所有大鼠編碼后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：假燒傷組，模型組，磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組，各30只。參照鄭國(guó)鈺等[5]報(bào)道的方法制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型：各組大鼠禁食禁水12 h后，腹腔注射水合氯醛溶液（濃度10%，劑量0.3 mL/100 g）實(shí)施麻醉，剃除背部毛發(fā)后用8%的Na2S溶液脫毛，溫水沖洗并用75%乙醇消毒，假燒傷組立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5 mL抗休克；其余各組大鼠均采用燙傷儀制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，參數(shù)設(shè)置為：壓力0.03 MPa、溫度106℃持續(xù)時(shí)間5 s，通過(guò)病理切片證實(shí)造模成功（病理切片呈現(xiàn)：部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細(xì)血管擴(kuò)張、管腔可見(jiàn)紅細(xì)胞及血液瘀滯），見(jiàn)圖1。造模完成后各組大鼠立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5 mL抗休克。

圖1 創(chuàng)面皮膚病理切片

1.4 干預(yù)方法 1）大蒜素劑量確定：成人使用劑量為60～120 mg/d，取平均值90 mg/d，設(shè)定人體質(zhì)量為60 kg，則人每天給藥劑量為1.5 mg/kg。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量換算公式，大鼠給藥劑量=6.3×人給藥劑量，得出給藥劑量為9.45 mg/kg≈10 mg/kg，因此本實(shí)驗(yàn)取10 mg/kg為中劑量組，并設(shè)低劑量組5 mg/kg和高劑量組20 mg/kg。2）取大蒜素注射液加入適量0.9%氯化鈉溶液制備質(zhì)量濃度為2.5、5、10 mg/mL的大蒜素溶液，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組于燒傷創(chuàng)面涂抹磺胺嘧啶銀軟膏（每2日換藥1次），同時(shí)分別每日1次腹腔注射2.5、5、10 mg/mL的大蒜素溶液2 mL/kg，假燒傷組和模型組每日1次腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏（每2日換藥1次），同時(shí)每日1次腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL/kg。各組療程均為14 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）創(chuàng)面狀況觀察及創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查。治療14 d后觀察各組大鼠燒傷創(chuàng)面狀況，包括皮膚顏色、結(jié)痂狀況、分泌物、愈合狀況等。各組分別隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創(chuàng)面皮膚組織，置4%多聚甲醛溶液72 h實(shí)施固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色、梯度酒精脫蠟、二甲苯透明后中性樹脂封片，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察。2）創(chuàng)面愈合率的計(jì)算。各組隨機(jī)取10只大鼠，分別于給藥第0、14日后拍照燒傷創(chuàng)面，計(jì)算創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率（%）=（初始創(chuàng)面面積-未愈創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。3）創(chuàng)面組織含水量的測(cè)定。將大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，切取創(chuàng)面皮膚組織，沖洗干凈后稱重（W1），置80℃烤箱烘烤24 h至恒重后稱量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。4）創(chuàng)面組織HYP、MDA含量和SOD、CAT活性的測(cè)定。各組分別取剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，切取創(chuàng)面皮膚組織，于冰上剪碎后，加入9倍量冷裂解液行研磨勻漿，恒溫4℃離心（3 000 r/min，10 min）取上清，然后按照試劑盒操作方法，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組大鼠創(chuàng)面組織HYP、MDA含量和SOD、CAT活性。5）EGF、bFGF蛋白表達(dá)量的測(cè)定。取創(chuàng)面組織勻漿液，恒溫4℃離心（12 000 r/min，15 min）取上清，BCA法測(cè)定總蛋白含量后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，滴加兔抗鼠EGF、bFGF單抗（稀釋倍數(shù)1∶3 000）和兔抗鼠β-actin單抗（稀釋倍數(shù)1∶1 000）后4℃孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗（稀釋倍數(shù)1∶500，37℃振蕩孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL顯色發(fā)光，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量EGF、bFGF蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊兩兩比較行t檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane′st2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面狀況觀察結(jié)果 給藥治療14 d后，假燒傷組大鼠創(chuàng)面毛發(fā)生長(zhǎng)茂盛，毛發(fā)長(zhǎng)度基本恢復(fù)；模型組大鼠創(chuàng)面新生肉芽較少、結(jié)痂厚度不均勻，部分基底仍有黃色液體滲出；磺胺嘧啶銀軟膏組創(chuàng)面縮小、大部分痂下愈合，無(wú)滲出；磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組創(chuàng)面呈不同程度縮小、大部分痂下愈合，無(wú)滲出，新愈合皮膚紅潤(rùn)，毛發(fā)開始生長(zhǎng)，其中磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組效果最為顯著。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查結(jié)果 見(jiàn)圖2。觀察HE染色病理切片發(fā)現(xiàn)：假燒傷組大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；模型組創(chuàng)面出現(xiàn)較薄的新生上皮組織，可見(jiàn)壞死組織以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組上皮組織成熟較好、排列整齊，汗腺、皮脂腺等結(jié)構(gòu)較為完整但仍較表淺，其中磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組可見(jiàn)表皮生成。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率測(cè)定結(jié)果比較 見(jiàn)表1。較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面組織含水量比較（%，±s）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面組織含水量比較（%，±s）

與假燒傷組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。下同

n組 別 愈合率 含水量假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組10 10 10 10 10 10-30.17±4.62 58.54±6.96△△61.27±7.03△△65.38±7.41△△#71.65±8.69△△##68.09±1.25 70.26±1.31**69.75±1.28 69.02±1.30△68.57±1.24△△68.23±1.19△△#

2.4 各組大鼠創(chuàng)面組織含水量測(cè)定結(jié)果比較 見(jiàn)表1。較假燒傷組，模型組大鼠創(chuàng)面組織含水量顯著升高（P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組創(chuàng)面組織含水量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組創(chuàng)面組織含水量顯著降低（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織HYP含量比較 見(jiàn)表2。較假燒傷組，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏組及磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織HYP含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組HYP含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組HYP含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織HYP含量比較（μg/mg，±s）

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織HYP含量比較（μg/mg，±s）

n組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組10 10 10 10 10 10 HYP 17.34±2.21 19.95±2.57*20.13±2.69*22.07±3.14**23.46±3.25**△#26.18±3.40**△△##

2.6 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 見(jiàn)表3。較假燒傷組，模型組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量顯著升高，且SOD、CAT活性顯著降低（P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組MDA含量顯著降低，且SOD、CAT活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組MDA含量降低，且SOD、CAT活性升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較（±s）

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織MDA含量和SOD、CAT活性比較（±s）

組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組n 10 10 10 10 10 10 MDA（nmol/mg）0.97±0.18 4.63±0.72**4.40±0.75 3.79±0.68△2.66±0.49△△##1.85±0.36△△##SOD（U/mg）28.15±2.07 11.49±1.28**11.63±1.19 12.54±1.32 15.38±1.51△△##19.46±1.70△△##CAT（U/mg）23.74±1.93 14.65±1.22**14.28±1.37 15.91±1.53 16.24±1.86△#18.55±2.17△△##

2.7 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF蛋白表達(dá)量比較見(jiàn)圖3，表4。較假燒傷組，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏組及磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；較模型組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低、中、高劑量組EGF、bFGF蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；較磺胺嘧啶銀軟膏組，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中、高劑量組EGF、bFGF蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織EGF、bFGF蛋白表達(dá)量比較（±s）

組別假燒傷組模型組磺胺嘧啶銀軟膏組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素低劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素中劑量組磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素高劑量組n 10 10 10 10 10 10 EGF β-actin 0.23±0.05 0.29±0.06*0.32±0.08**0.38±0.12**△0.52±0.10**△△##0.64±0.14**△△##bFGF β-actin 0.13±0.02 0.15±0.03*0.18±0.04**0.23±0.07**△△0.40±0.08**△△##0.51±0.12**△△##

3 討 論

燒傷創(chuàng)面處理是燒傷救治過(guò)程中的重點(diǎn)，良好的創(chuàng)面治療是改善燒傷患者生存質(zhì)量、提高患者預(yù)后的關(guān)鍵。燒傷患者中以深Ⅱ度燒傷較為多見(jiàn)，其病理特點(diǎn)為燒傷創(chuàng)面雖然深度達(dá)真皮層，但仍有部分真皮組織及毛囊、汗腺等皮膚附件存活，創(chuàng)面治療及時(shí)有效則能夠依賴上皮增殖實(shí)現(xiàn)自行愈合，減輕燒傷瘢痕而改善外觀，降低傷殘[6]；若創(chuàng)面處理不當(dāng)，則可能導(dǎo)致創(chuàng)面加深而轉(zhuǎn)變成Ⅲ度燒傷，從而增加治療難度并嚴(yán)重影響患者預(yù)后[7]。所以，深Ⅱ度燒傷治療結(jié)局具有較大的可變性，也是燒傷相關(guān)研究的熱點(diǎn)。

燒傷具有復(fù)雜的病理變化過(guò)程，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)在其疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠降低燒傷大鼠心肌、肺、腎臟組織并發(fā)癥損傷[9-12]；胡澤華等[13]研究發(fā)現(xiàn)馬桑水提取物能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷而促進(jìn)深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面組織愈合。大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種二烯丙基三硫化物，具有良好的抗氧化活性[3]?；前粪奏ゃy軟膏具有清理創(chuàng)面、促進(jìn)愈合的作用，是臨床燒傷治療的常用外用藥[14]。本研究通過(guò)制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型并在外用磺胺嘧啶銀軟膏的前提下，研究大蒜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合的影響，結(jié)果顯示：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著改善創(chuàng)面愈合狀況、改善創(chuàng)面組織病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，提高創(chuàng)面愈合率，提示大蒜素具有促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用。

燒傷導(dǎo)致創(chuàng)面組織表皮細(xì)胞腫脹、毛細(xì)血管通透性增高而導(dǎo)致水腫，致使局部微循環(huán)障礙而影響創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面組織中HYP可作為膠原含量檢測(cè)的標(biāo)志物，能夠反映創(chuàng)面愈合程度。本研究發(fā)現(xiàn)：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著降低創(chuàng)面組織含水量、提高HYP含量，這可能是大蒜素促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合作用機(jī)制之一。

燒傷創(chuàng)面處于氧缺乏病理狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基（ROS）大量產(chǎn)生和過(guò)剩，機(jī)體內(nèi)具有完整的ROS清除酶系統(tǒng)，其中SOD能夠?qū)OS還原成過(guò)氧化氫（H2O2），并在過(guò)氧化氫酶（CAT）作用下進(jìn)一步還原生成水和氧[15]；MDA是ROS所致過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。所以，MDA含量及SOD、CAT活性能夠間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著降低創(chuàng)面組織MDA含量并提高SOD、CAT活性，這可能也是大蒜素促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合作用機(jī)制之一。

生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化、合成與分泌多種創(chuàng)面愈合所需物質(zhì)，從而表現(xiàn)出促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的多種生理學(xué)功能[16]。EGF是一種由53個(gè)氨基酸組成的多肽類物質(zhì)，具有促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞增殖的生理作用，并且能夠促進(jìn)血管新生和核酸蛋白質(zhì)合成[17]；b-FGF是一種由155個(gè)氨基酸組成的多肽，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移，并促進(jìn)創(chuàng)面上皮組織生成[18]；劉川玉等[19]證實(shí)EGF和b-FGF對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合具有重要促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)：與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+大蒜素治療能夠顯著上調(diào)創(chuàng)面組織EGF、b-FGF蛋白表達(dá)，這可能也是大蒜素促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的另一機(jī)制。

綜上所述，大蒜素具有促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用，其機(jī)制可能與改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高HYP含量及上調(diào)EGF、b-FGF蛋白表達(dá)有關(guān)。