從“五臟相關(guān)”理論探討肝脾腎同治法抗大鼠免疫損傷性肝纖維化的機(jī)制?

劉 定 楊沈秋 張 禹△ 潘祥賓 黃秋思

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

肝纖維化是一種可逆的損傷愈合反應(yīng)，其病理特征是肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積累[1]。肝纖維化是慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段，目前西醫(yī)尚缺乏明確臨床用藥，因此，如何阻止肝纖維化進(jìn)程具有重要意義。課題前期臨床研究[2-3]發(fā)現(xiàn)肝脾腎同治法具有抗肝纖維化作用。為進(jìn)一步明確其對肝纖維化中關(guān)鍵環(huán)節(jié)HSC活化和ECM降解的影響，本研究通過觀察肝纖維化大鼠中核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、金屬蛋白酶組織抑制-1（TIMP-1）表達(dá)情況探討肝脾腎同治法抗肝纖維化的分子機(jī)制。

第一，不斷提升自身的知識文化修養(yǎng)和執(zhí)政能力。地方政府官員是群眾中的精英，只有具備淵博的學(xué)識和高度的政治覺悟才能具有處理各種復(fù)雜問題的能力。因而作為官員要勤于學(xué)習(xí)，多讀書，多看報(bào)，多上網(wǎng)，了解我國傳統(tǒng)文化的主要內(nèi)容，掌握馬克思列寧主義基本理論，懂得科學(xué)發(fā)展觀，熟練掌握地方政府的各項(xiàng)方針政策，依據(jù)上級指示嚴(yán)格要求自己。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價(jià)中心提供，合格證號：SCXK（黑）2014-004，本實(shí)驗(yàn)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，編號DXLL2015081001。所有動物自由飲水飲食，正常飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

肝脾腎同治法組方：柴胡10 g，白芍15 g，丹參30 g，莪術(shù)10 g，鱉甲25 g，黃芪30 g，淫羊藿15 g，白術(shù)20 g，茯苓15 g，甘草10 g。藥材由安徽晉仁中藥飲片有限責(zé)任公司提供，符合2015年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，煎煮前浸泡2 h，鱉甲先煎2 h，再加入其他藥材加水煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至生藥含量2.174 g/mL，置4℃冰箱備用。鱉甲煎丸（武漢中聯(lián)藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字號：Z42020772），主要成分：鱉甲膠、阿膠、炒蜂房、炒土鱉蟲、鼠婦蟲、蜣螂、大黃、桃仁、牡丹皮、射干、黃芩、柴胡、干姜、炒白芍、桂枝、葶藶子、石韋、姜厚樸、瞿麥、法半夏、硝石、黨參。臨用時(shí)研末以蒸餾水配制成混懸液，質(zhì)量濃度為0.233 g/mL。

1.3 試劑與儀器

無菌豬血清由廣州鴻泉生物科技有限公司提供，批號20180101；NF-κB p65和α-SMA抗體由Wanleibo公司提供，批號分別為WL01273b和WL0002a；生物素化山羊抗兔IgG由碧云天公司提供，批號：A0277；辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素由碧云天公司提供，批號：A0303；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析（ELISA法）試劑盒由上海臥宏公司提供，批號：DZE30635；蘇木精、山羊血清由Solarbio公司提供，批號分別為H8070和SL2-10；TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技（北京）有限公司提供，批號：DP405-02。德國萊卡2135型切片機(jī)；Proline微量移液器；ELX-800酶標(biāo)儀；美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)；DHG-9031A電熱恒溫箱；OLYMPUSDP73顯微鏡；Heal Force-NW10LVF超純水系統(tǒng)；Eppendorf-Centrifuge 5415D離心機(jī)；Applied Biosystems-ABI7500熒光定量PCR儀；美國Thermo-902-ULTS超低溫冰箱。

1.4 分組與造模

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一般數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)數(shù)資料比較采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，等級資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 給藥方法

1.6.4 Real Time PCR檢測大鼠肝組織TIMP-1 mRNA表達(dá) 采用Trizol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，各樣品的目的基因（TIMP-1上游引物：ACAGCTTTCTGCAACTCGGA，TIMP-1下游引物：CAGCGTCGAATCCTTTGAGC）；和內(nèi)參（ACTIN上游引物：CCTAAGGCCAACCGTGAAAA，ACTIN下游引物：GACCAGAGGCATACAGGGACA）分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

健康管理傳入中國后，國家政策給予了較大程度的支持，使得健康管理有了一定的發(fā)展。2016年8月，由中國醫(yī)藥新聞信息協(xié)會主辦，中國保健協(xié)會、中華醫(yī)學(xué)會健康管理學(xué)分會等單位支持的中國首屆精準(zhǔn)健康管理高峰論壇暨精準(zhǔn)健康管理分會成立大會在京召開。這次會議的召開標(biāo)志著我國健康管理已經(jīng)從經(jīng)典的健康管理進(jìn)入了精準(zhǔn)健康管理的新高度。[8]精準(zhǔn)健康管理是建立在個(gè)體基因檢測的基礎(chǔ)上，結(jié)合健康體檢尤其是免疫細(xì)胞功能檢測、健康檔案、生活方式、動態(tài)監(jiān)測和大數(shù)據(jù)分析解讀等，對個(gè)體和不同人群提供精準(zhǔn)健康評估、干預(yù)、督導(dǎo)、健康教育管理服務(wù)。精準(zhǔn)健康管理時(shí)代的來臨無疑為構(gòu)建中國特色的健康管理模式提供了新的思路和要求。[9]

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給藥結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，解剖取出肝臟，沿肝臟長軸切取約2 mm厚的肝組織放入10%中性甲醛中固定，常規(guī)制備肝組織切片，切片厚度約5 μm；另外取大鼠左葉肝組織100 mg液氮速凍，-80℃保存；再取新鮮肝組織約500 mg，按1∶9加入冰生理鹽水，制成10%肝勻漿4℃，4 500 r/min離心15 min，取上清液分裝，-20℃保存。

1.6.2 免疫組化檢測大鼠肝組織NF-κB p65、α-SMA表達(dá) 包埋切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，3%過氧化氫孵育，山羊血清封閉，一抗NF-κB p65、α-SMA孵育濕盒內(nèi)4℃過夜，二抗?jié)窈袃?nèi)37℃孵育30 min。辣根酶標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染脫水、透明、封片，400倍鏡檢觀察蛋白表達(dá)，利用Image-Pro Plus（IPP）6.0圖像處理分析軟件分析陽性面積和累計(jì)光密度值，結(jié)果予以平均光密度（累計(jì)光密度值/陽性面積）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

人體正常吞咽功能由雙側(cè)大腦多處皮質(zhì)及皮質(zhì)下激活，而腦卒中后吞咽障礙患者的相關(guān)腦區(qū)則存在功能障礙[4] 。經(jīng)顱直流電刺激法則可釋放微弱電流，并通過電極而使腦興奮，從而能改夠變腦中樞的興奮性，達(dá)到改善吞咽障礙的作用。綜上可見，針對腦卒中后吞咽功能障礙的患者，在給予常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練的基礎(chǔ)上，再聯(lián)合經(jīng)顱直流電刺激法進(jìn)行治療，效果較好，故值得推廣。

開始開藥，正常組、模型組給予生理鹽水6.7 mL/kg灌胃；肝脾腎同治組給予水煎劑6.7 mL/kg灌胃；鱉甲煎丸組給予鱉甲煎丸混懸液6.7 mL/kg灌胃。各組均每日1次，持續(xù)6周。

1.6.1 肝臟病理觀察 使用HE染色觀察大鼠肝臟病理學(xué)改變。Metavir評分系統(tǒng)[5]對肝組織病理分期進(jìn)行分級。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、肝脾腎同治組、鱉甲煎丸組[4]，每組各12只。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組外，其余3組使用未滅活的豬血清腹腔注射，固定時(shí)間為周二、周五上午9點(diǎn)，每次每只0.5 mL，每周兩次，連續(xù)注射8周。造模結(jié)束模型組隨機(jī)處死2只大鼠，取肝組織做HE染色，Metavir分期在F2以上證實(shí)造模成功[5]。

1.6.3 ELISA法檢測大鼠肝組織TNF-α表達(dá) 采用大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒，嚴(yán)格按照說明書流程操作，用空白孔調(diào)零，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，調(diào)零后的吸光度（A值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 肝脾腎同治法對肝纖維化大鼠肝臟病理的影響

見圖1，表1。與正常組相比較，模型組Metavir分期顯著增高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組相比較，鱉甲煎丸組和肝脾腎同治組Metavir分期顯著降低（P＜0.05），與鱉甲煎丸組相比較，肝脾腎同治組Metavir分期顯著降低（P＜0.05）。

圖1 各組肝組織病理切片（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠Metavir肝臟纖維分期比較（n）

2.2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA蛋白表達(dá)比較

見圖2～圖3，表2。鏡下觀察以細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色改變?yōu)镹F-κB p65、α-SMA蛋白陽性標(biāo)記。與正常組比較，模型組NF-κB p65、α-SMA表達(dá)顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，肝脾腎同治組、鱉甲煎丸組NF-κB p65、α-SMA均明顯降低（P＜0.01）；與鱉甲煎丸組相比較，肝脾腎同治組NF-κB p65、α-SMA水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠NF-κB p65、α-SMA、TNF-α、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

與正常組比較，?P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與鱉甲煎丸組比較，△P＜0.05

n組別正常組模型組肝脾腎同治組鱉甲煎丸組12 10 12 12 NF-κB p65 0.071±0.006 0.133±0.010*0.085±0.005#△0.095±0.013#α-SMA 0.053±0.007 0.121±0.014*0.087±0.010#△0.098±0.012#TNF-α（ng/L）110.28±11.55 171.57±10.24*125.13±9.63#△134.43±7.81#TIMP-1 mRNA 1.00±0.00 2.31±0.24*1.31±0.17#1.23±0.11#

2.3 各組大鼠TNF-α表達(dá)比較

圖2 各組NF-κB p65免疫組化（DAB染色，400倍）

圖3 各組α-SMA免疫組化（DAB染色，400倍）

見表2。ELISA法檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織TNF-α水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肝脾腎同治組和鱉甲煎丸組TNF-α均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肝脾腎同治組TNF-α低于鱉甲煎丸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠TIMP-1 mRNA表達(dá)比較

見表2。模型組與正常組比較，大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。鱉甲煎丸組、肝脾腎同治組與模型組比較，大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01）。肝脾腎同治組與鱉甲煎丸組TIMP-1 mRNA的相對表達(dá)量相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

?車宇彤、相妍:《就地城鎮(zhèn)化中的新型農(nóng)村社區(qū)建設(shè)——以長春市三個(gè)典型村為例》，《勞動保障世界》2017年第5期。

3 討 論

肝纖維化根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于“脅痛”“積聚”等范疇。本病病位在肝，與脾、腎關(guān)系密切，病機(jī)特點(diǎn)為“虛實(shí)夾雜”，其中正虛以肝、脾、腎虧虛為主，邪實(shí)以血瘀為要。中醫(yī)藏象學(xué)說認(rèn)為五臟相關(guān)，疾病過程中，很可能反映了三臟甚至多臟系統(tǒng)之間的病理關(guān)系[6]?！端貑枴び駲C(jī)真臟論》有云“五臟相通，移皆有次。五臟有病，則各傳其所勝……肝受氣于心，傳之于脾，氣舍于腎”，說明肝纖維化病位雖然在肝，在疾病進(jìn)展過程中可傳變他臟，同時(shí)，其他臟腑功能失調(diào)亦可影響本臟，成為本病的病因或加重因素。從肝脾間關(guān)系來看，一方面，脾的運(yùn)化功能有賴于肝氣的疏泄，《素問·寶命全形論》曰“土得木而達(dá)”。同時(shí)，肝的功能也有賴于脾胃滋養(yǎng)，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載“肝多脾相助為理之臟也……實(shí)脾即所以理肝”。從肝腎間關(guān)系來看，肝與腎同居下焦，在五行生克關(guān)系上有母子相生關(guān)系，即母實(shí)則子壯，水涵則木榮。明代李中梓在《醫(yī)宗必讀·乙癸同源論》中明確提出“乙癸同源，腎肝同治”之說。研究發(fā)現(xiàn)疏肝健脾、補(bǔ)腎活血法具有一定抗纖維化作用[7-9]。結(jié)合“五臟相關(guān)”分析，機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)可以看作是臟腑間平衡的微觀體現(xiàn)，臟腑之間的平衡協(xié)調(diào)是機(jī)體維持正常生命活動的基礎(chǔ)。肝纖維化的發(fā)生也可以認(rèn)為是這種平衡協(xié)調(diào)、整體統(tǒng)一遭到破壞的結(jié)果，因此肝脾腎同治就是旨在調(diào)整臟腑之間紊亂的狀態(tài)，以恢復(fù)機(jī)體內(nèi)在環(huán)境的平衡。研究發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞是纖維化過程中產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞，而HSC是肝臟肌成纖維細(xì)胞的主要細(xì)胞來源之一，約占82%～96%[10]。HSC激活后，自分泌和旁分泌大量的TIMP-1，導(dǎo)致ECM的過度沉積[1]。越來越多的證據(jù)表明，NF-κB 可促進(jìn)慢性炎癥的進(jìn)展[11]，NF-κB信號被激活，導(dǎo)致其下游靶基因TNF-α在肝臟損傷過程中異常表達(dá)[12]，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并進(jìn)一步誘導(dǎo)受損肝細(xì)胞凋亡[13]。NF-κB和TNF-α之間的正反饋循環(huán)進(jìn)一步加重了炎癥和肝損傷水平[14]，NF-κB的活化有助于活化的HSC生存[1]，而抑制NF-κB可以促進(jìn)活化的HSC凋亡[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝脾腎同治法能減少肝臟組織NF-κB、TNF-α、α-SMA、TIMP-1 mRNA的表達(dá)，提示肝脾腎同治法抗肝纖維化機(jī)制可能與減輕肝臟細(xì)胞周圍的炎癥環(huán)境，促進(jìn)活化的HSC凋亡及ECM的降解有關(guān)。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝脾腎同治組在Metavir肝纖維化分期，NF-κB、TNF-α、α-SMA表達(dá)上具有一定優(yōu)勢，基于中藥多靶點(diǎn)藥物作用，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究明確基于“五臟相關(guān)”理論的肝脾腎同治法在調(diào)節(jié)肝纖維化過程中重要相關(guān)分子及細(xì)胞平衡上的作用。