麻杏解毒合劑治療新冠肺炎分子機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究?

易國(guó)祥 付 玉 李延萍 吳 斌 王守富

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）臨床以發(fā)熱、乏力、干咳為主要臨床癥狀，有特征性影像學(xué)改變，部分患者發(fā)生嚴(yán)重急性呼吸道感染、呼吸衰竭等并發(fā)癥[1]。中醫(yī)藥治療新冠肺炎在疫情防控中發(fā)揮了重大作用。重慶市中醫(yī)院根據(jù)新冠肺炎的病因病機(jī)，總結(jié)臨床診治經(jīng)驗(yàn)，擬定了麻杏解毒合劑，全方由麻黃、杏仁、石膏、浙貝母、蟬蛻、僵蠶、桔梗等藥物組成，具有辛涼宣肺平喘、解毒清肺化濁的功效，治療新冠肺炎早期邪熱壅肺，證見(jiàn)發(fā)熱、咳嗽、痰少、氣喘、胸悶等。麻杏解毒合劑在重慶市抗擊新冠肺炎疫情中取得了良好的療效，現(xiàn)已獲批院內(nèi)制劑。本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析該復(fù)方的分子機(jī)理，為后續(xù)的機(jī)制研究提供參考。

1 研究方法

1.1 麻杏解毒合劑活性成分信息收集 在TCMSP[2]數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索麻杏解毒合劑11味中藥的活性成分，設(shè)置篩選閾值：口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 提取麻杏解毒合劑11味中藥的活性成分的分子ID，通過(guò)分子ID在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)信息。

1.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[3]（http：//www.genecards.org/）可以提供已知或正在探索的基因信息。以“Viral pneumonia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行捜索，收集與病毒性肺炎相關(guān)的基因靶點(diǎn)。

1.4 交集靶點(diǎn)的獲取 結(jié)合GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)建立的疾病靶點(diǎn)，應(yīng)用 Venny 2.1[4]（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取麻杏解毒合劑活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，作為麻杏解毒合劑治療病毒性肺炎的靶點(diǎn)分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的交集靶基因?qū)隨tring10[5]（https：//string-db.org/），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，再將文本數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape[6]中構(gòu)建麻杏解毒合劑的可視化靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，在網(wǎng)絡(luò)中篩選出起調(diào)控作用的關(guān)鍵蛋白。

1.6 網(wǎng)絡(luò)分析 使用David[7]在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集靶點(diǎn)基因的GO生物學(xué)過(guò)程（GOBP）和KEGG通路（KEGG Pathway）進(jìn)行富集分析，并以P=0.05作為顯著功能與通路的臨界值。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分的篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 根據(jù)TCMSP平臺(tái)中OB和DL的界定值篩選，從麻杏解毒合劑9味中藥（數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄石膏、僵蠶）中篩選出92個(gè)候選活性成分，其中麻黃23個(gè)、杏仁19個(gè)、浙貝母7個(gè)、蟬蛻8個(gè)、姜黃3個(gè)、桔梗7個(gè)、枳殼5個(gè)、草果8個(gè)、豆蔻12個(gè)。92個(gè)候選活性成分對(duì)應(yīng)1 199個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Viral pneumonia”，共得到3 473個(gè)相關(guān)基因。以“Score＞5”為條件進(jìn)行篩選，滿足條件的有971個(gè)，以此作為疾病候選靶點(diǎn)基因。

2.3 活性成分-疾病交集靶點(diǎn)結(jié)果 應(yīng)用Venny 2.1在線軟件對(duì)92個(gè)有效成分的1 199個(gè)作用靶點(diǎn)與病毒性肺炎的971個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，獲得52個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 活性成分—疾病交集靶點(diǎn)Venny圖

2.4 成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.3.0軟件，對(duì)中藥、活性成分、病毒性肺炎及交集靶點(diǎn)構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。在互作網(wǎng)絡(luò)中，包括154個(gè)節(jié)點(diǎn)（9味中藥、92個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、52個(gè)靶點(diǎn)和1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)）和947條邊，見(jiàn)圖2。其中，1個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的線路數(shù)。根據(jù)Degree由大到小排序，選取前30位，結(jié)果見(jiàn)表1。有28個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)Degree≥10個(gè)，提示這些活性成分在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用。

圖2 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖

表1 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病節(jié)點(diǎn)Degree值

2.5 麻杏解毒合劑靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將藥物與疾病的52個(gè)交集靶點(diǎn)運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)建立麻杏解毒合劑靶點(diǎn)蛋白相互（PPI）網(wǎng)絡(luò)。取評(píng)分值高于0.9，置信度最高的數(shù)據(jù)，隱藏散點(diǎn)值制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3A。顯示該網(wǎng)絡(luò)涉及52個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)和92條連線，平均節(jié)點(diǎn)的度為3.54，平均局部聚類系數(shù)0.341（P＜1.0～16）。用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示Degree值，節(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)的Degree值越大，顏色由紅變藍(lán)對(duì)應(yīng)的Degree值也越大；用邊的粗細(xì)表示Combine score值的大小，邊越粗，Combine score值越大。根據(jù)Degree≥20的節(jié)點(diǎn)制作出前30個(gè)關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)的條形圖，如JUN、MAKP1、MAKP8、APP、ESR1、IL-6等，見(jiàn)圖3B，提示這些關(guān)鍵蛋白是網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。

圖3 麻杏解毒合劑-病毒肺炎交集靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO富集與KEGG通路富集分析 將52個(gè)交集靶基因?qū)隓AVID在線軟件進(jìn)行GO富集分析，麻杏解毒合劑在體內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)52個(gè)潛在靶點(diǎn)基因，進(jìn)而調(diào)控48個(gè)生物過(guò)程，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控（negative regulation of gene expression）、血壓調(diào)節(jié)（regulation of blood pressure）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter）、T細(xì)胞增殖正調(diào)控（positive regulation of T cell proliferation）等，見(jiàn)圖4。

圖4 GO富集圖

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)麻杏解毒合劑的靶點(diǎn)主要富集在69條信號(hào)通路上，其中感染相關(guān)通路16條，如Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、甲型流感（Influenza A）、單純皰疹感染（Herpes simplex infection）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等。免疫炎癥相關(guān)7條，如Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）等。神經(jīng)內(nèi)分泌12條，如心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、多巴胺能突觸（Dopaminergic synapse）等。細(xì)胞功能通路11條，如ErbB信號(hào)通路（ErbB signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等。疾病相關(guān)通路22條，如癌癥通路（Pathways in cancer）、炎性腸?。↖nflammatory bowel disease）等。KEGG通路富集的Pathway富集柱狀圖見(jiàn)圖5。

圖5 部分KEGG通路富集圖

3 討 論

3.1 麻杏解毒合劑與新冠肺炎 新冠肺炎是一種由病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，發(fā)病迅速，傳播很快。根據(jù)新冠肺炎流行病學(xué)特點(diǎn)，歸屬于中醫(yī)學(xué)“疫毒”“疫癘”“瘟疫”“溫疫”“濕毒疫”等范疇[8-9]。病因?yàn)楦惺堋耙甙O”之邪，從口鼻而入，首先犯肺，病位在肺；關(guān)于病性，不同地區(qū)、學(xué)者有不同看法，如“寒濕疫”“濕毒疫”“濕疫”等[10]。麻杏解毒合劑是以麻杏石甘湯和升降散化裁而成，方中麻杏石甘湯辛涼宣泄，清肺平喘，用于外感風(fēng)寒郁而化熱，熱壅于肺；升降散升清降濁，散風(fēng)清熱，治溫病表里三焦之大熱。因甘草滋膩礙邪，大黃苦寒瀉下傷正氣，故去甘草、大黃；加桔梗、浙貝母宣肺化痰，草果、豆蔻溫中化濁，共奏辛涼宣肺平喘、解毒清肺化濁之功。麻杏解毒合劑為重慶市新冠肺炎中醫(yī)診療方案推薦的代表方劑。

3.2 麻杏解毒合劑的核心靶點(diǎn)和功能 從表1可見(jiàn)麻黃、豆蔻、草果在中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中的Degree值最高，表明這3味中藥的核心作用。在藥物與疾病的52個(gè)交集靶點(diǎn)中，如圖3所示，JUN、MAPK1、MAPK8、APP、ESR1、IL-6、EGFR、MAPK14、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，其功能涉氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺氧反應(yīng)等。與炎癥細(xì)胞因子調(diào)控相關(guān)的MAPK14，NOS2等，總共涉及48個(gè)生物過(guò)程（見(jiàn)圖4），均與疾病、藥物靶點(diǎn)密切相關(guān)。如有研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯能降低重癥肺炎患者的炎性反應(yīng)，改善呼吸功能，減緩病情進(jìn)展[11]。升降散對(duì)膿毒癥患者心臟有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用的機(jī)制可能與提高抗氧化能力有關(guān)[12]。

3.3 麻杏解毒合劑與信號(hào)通路 如圖5所示，KEGG通路富集了麻杏解毒合劑69條通路，首先是與感染相關(guān)通路，如EB病毒感染、甲型流感等。新冠肺炎易誘發(fā)低氧血癥，HIF-1信號(hào)通路在機(jī)體對(duì)低氧濃度或缺氧應(yīng)答中至關(guān)重要，在缺氧條件下充當(dāng)了許多缺氧誘導(dǎo)基因的主要調(diào)節(jié)因子，不僅可以通過(guò)降低氧氣利用率，而且還可以通過(guò)其他刺激物（如一氧化氮或各種生長(zhǎng)因子）來(lái)誘導(dǎo)一系列的適應(yīng)性反應(yīng)[13]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，麻杏石甘湯對(duì)流感病毒致感染鼠肺部炎癥引起的肺泡、細(xì)支氣管等正常組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用[14]。其次則是與免疫炎癥相關(guān)通路，如Toll樣受體和NOD樣受體信號(hào)通路均為固有免疫。作為機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線，固有免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原體相關(guān)模式分子繼而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，以發(fā)揮固有免疫效應(yīng)，清除入侵的病原體[15-16]。當(dāng)NOD樣受體及Toll樣受體信號(hào)通路被刺激后可激活干擾素信號(hào)通路，進(jìn)而激動(dòng)T細(xì)胞、B細(xì)胞受體信號(hào)通路，調(diào)動(dòng)適應(yīng)性免疫，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子[17-18]。通過(guò)TNF和NF-κB信號(hào)通路的放大作用[19]，Rap1信號(hào)通路介入了急性肺損傷[20]。此外，還有與神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)相關(guān)通路，如調(diào)動(dòng)了腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)、多巴胺能突觸信號(hào)等功能。最后，還有與細(xì)胞功能通路和疾病相關(guān)通路，如參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等的MAPK信號(hào)通路；與癌癥、炎性腸病、類風(fēng)濕等疾病相關(guān)通路等。從上述信號(hào)通路可推測(cè)，麻杏解毒合劑能改善呼吸功能，提高低氧的適應(yīng)性反應(yīng)，調(diào)動(dòng)固有和適應(yīng)性免疫，減少炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損傷，同時(shí)也影響著細(xì)胞的多方面生理功能，參與多種疾病的干預(yù)作用。

綜上所述，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了麻杏解毒合劑治療新冠肺炎的可能機(jī)制，為下一步研究提供了思路。本研究也存在著一些不足，一方面盡管筆者檢索了多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，但均未檢索到石膏和僵蠶的活性成分，尤其石膏是本處方的重要藥物，因此對(duì)結(jié)果會(huì)有一定的影響；另一方面因?yàn)樾鹿诜窝资且环N新的疾病，現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)還未收錄該疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，所以本研究選擇了病毒性肺炎的靶點(diǎn)來(lái)開(kāi)展研究。