一株仿刺參源鼠李糖乳桿菌XX-11 生物學(xué)特性研究

鄒文政 林松泉 李忠琴 喬欣君 林章秀

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021；2.廈門惠盈動(dòng)物科技有限公司，福建廈門361023）

在養(yǎng)殖業(yè)中，隨著抗生素、化學(xué)殺菌劑的普遍使用，已經(jīng)逐漸地帶來一系列的弊端，如病菌耐藥性產(chǎn)生、藥物殘留、腸道正常菌群失調(diào)，環(huán)境污染等。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)公告通知，2020 年全面禁抗：飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”，最終目的是要解決抗生素在環(huán)境污染、健康安全、耐藥性超強(qiáng)細(xì)菌等負(fù)面影響。所以養(yǎng)殖行業(yè)必將朝著減抗替抗的趨勢(shì)發(fā)展。在2019 年12 月份正式實(shí)施的《水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》和《水產(chǎn)動(dòng)物飼用芽孢桿菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)范了水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌特別是乳酸菌和芽孢桿菌的篩選，其中安全性規(guī)定所篩菌株對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物和人類都必須是安全的，且無抗生素耐藥性及致病性。

益生菌是有利于宿主健康作用的單細(xì)胞微生物或組成明確的混合微生物[1]，能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[2]，其與抗生素一樣具有抗菌活性卻無抗生素的種種副作用，是抗生素的重要替代品之一[3]。益生菌主要以乳酸菌類與芽孢桿菌類為主，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體環(huán)境及水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，且能定植腸道[4-7]。據(jù)報(bào)道[8]，為了防止有關(guān)疾病的發(fā)生，只有攝入含有106cfu/ml或以上的益生菌才能充分發(fā)揮其健康促進(jìn)特性。

益生菌經(jīng)胃到腸道內(nèi)的存活能力強(qiáng)弱，是直接關(guān)系到產(chǎn)品能否發(fā)揮有益作用。因此益生菌耐酸耐膽汁的特性是評(píng)價(jià)菌株是否能在腸道中生存與定植的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。一般對(duì)于作用于人體的益生菌的膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)，推薦膽鹽濃度為0.15%～0.3%[10]。根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)不同，人體胃液pH值具有不同程度的波動(dòng)，通常pH值維持在2.5～3.5之間，空腹pH值最低可達(dá)1.5，在進(jìn)食后pH值可上升至6或更高，通常食物在胃內(nèi)停留時(shí)間為2～4 h，流食通過胃的時(shí)間相對(duì)較短，一般1～2 h[11-13]。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，為革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧菌，屬于乳桿菌屬。目前鼠李糖乳桿菌被認(rèn)為是第三代微生物益生菌發(fā)酵菌種[14]，它不僅能夠在腸道中定植，能耐胃酸、膽汁，還能預(yù)防或治療腹瀉、預(yù)防齲齒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗癌等作用[15-16]。

課題組從仿刺參腸道內(nèi)分離得到一株益生菌，通過16S rRNA 測(cè)序及生理生化鑒定為鼠李糖乳桿菌XX-11，目前尚未見仿刺參源鼠李糖乳桿菌的相關(guān)報(bào)道。因此，本文對(duì)鼠李糖乳桿菌XX-11的部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)、生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）XX-11：由本實(shí)驗(yàn)室分離自健康仿刺參腸道，保存于-80 ℃冰箱。

抑菌試驗(yàn)指示菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GDMCC1.372、大腸桿菌(Escherichia coli)CMCC44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi-B）CMCC50094 購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心，創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、鰻弧菌（V. anguillarum）、副溶血性弧菌（V. Parahemo?lyticus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用MRS 培養(yǎng)基作為培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基，其中抑菌試驗(yàn)所用MRS培養(yǎng)基不加吐溫。

1.1.3 藥品試劑

10 種藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；胃蛋白酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司；豬膽鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 設(shè)備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；MJX-250 恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠；LDZX-50KBS 壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DW-86L400超低溫冰箱，浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司；TG-16M高速冷凍離心機(jī)，山東博科科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將保藏于-80 ℃低溫冰箱的鼠李糖乳桿菌XX-11凍存管取出，接種于斜面活化18 h后，轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量90 ml/100 ml，30 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.2 菌株鹽度耐受性試驗(yàn)

以MRS 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其中醋酸鈉改為氯化鈉來達(dá)到調(diào)節(jié)鹽度[17]。設(shè)置NaCl 質(zhì)量濃度分別為10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 g/l 液體培養(yǎng)基，裝液量200 ml/250 ml，按2%接種量接入活化菌液，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基濁度變化，確定菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.3 菌株適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)定試驗(yàn)

參考陳佩等[18]方法進(jìn)行，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)液按2%接種量接入裝液量400 ml/500 ml的MRS 液體培養(yǎng)基，分別在溫度25、30、35、40 ℃與45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，每隔4 h取樣檢測(cè)菌液OD600nm值。

1.2.4 菌株藥物敏感性試驗(yàn)

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[19]，吸取1 ml活菌數(shù)約為108cfu/ml 的菌液，加入15 ml MRS 瓊脂培養(yǎng)基中（50 ℃），混合均勻后傾注倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min后，將平皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌試驗(yàn)

采用管碟法[20-21]進(jìn)行菌-菌和菌培養(yǎng)液-菌的抑菌試驗(yàn)。鼠李糖乳桿菌XX-11于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液置4 ℃冰箱備用；菌沉淀用無菌生理鹽水清洗，離心，重復(fù)2 次后，用無菌生理鹽水重懸并調(diào)節(jié)菌濃度約為108cfu/ml，置4 ℃冰箱備用。取1 ml 指示菌菌懸液加入50 ℃100 ml MRS瓊脂培養(yǎng)基中搖勻（菌終濃度為105cfu/ml），倒入培養(yǎng)皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入0.20 ml上清液或菌懸液，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，其中弧菌采用30 ℃培養(yǎng)，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.6 菌株模擬胃液耐酸性試驗(yàn)

人工胃酸配置方法[22]：0.2 g NaCl與0.35 g胃蛋白酶溶解于適量蒸餾水中，用1 mol/l 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為2.0、2.5、3.0，用100 ml容量瓶定容至刻度。將鼠李糖乳桿菌活化后的培養(yǎng)液離心，取菌沉淀稀釋至活菌數(shù)約108cfu/ml，分別按1‰接種量加入不同pH 值的人工胃酸液體中，37 ℃水浴恒溫處理時(shí)間為0.5、1、2、4、6 h后，稀釋涂板，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，計(jì)算菌存活率。

1.2.7 菌株模擬腸液耐膽鹽試驗(yàn)

參照徐義剛等[23]、趙瑞香等[24]方法進(jìn)行，將鼠李糖乳桿菌XX-11活化后的培養(yǎng)液離心，取菌沉淀稀釋至活菌數(shù)約108cfu/ml，分別按1‰接種量分別加入0.3%、0.5%與0.7%質(zhì)量濃度的豬膽鹽溶液中，37 ℃水浴恒溫處理0.5、1、2、4 h 與6 h 后，稀釋涂板，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，計(jì)算菌存活率。

1.2.8 菌株安全性試驗(yàn)

參照冼瓊珍等[25]方法進(jìn)行，以鼠李糖乳桿菌XX-11 采用MRS 液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h 檢測(cè)活菌數(shù)后，放置4 ℃冰箱冷藏備用。15只健康小鼠，5只為正常對(duì)照組，飲潔凈水；另10 只為試驗(yàn)組，每天飲水添加鼠李糖乳桿菌XX-11 培養(yǎng)液，使菌終濃度為108cfu/ml，連續(xù)10 d，每天觀察小鼠生長(zhǎng)情況及10 d后小鼠內(nèi)臟器官是否出現(xiàn)病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鹽度耐受性

微生物對(duì)溶液滲透壓會(huì)有一定程度的耐受性，滲透壓低則出現(xiàn)細(xì)胞吸水而使細(xì)胞脹破，即水溶現(xiàn)象；滲透壓高則出現(xiàn)細(xì)胞失水，造成質(zhì)壁分離現(xiàn)象。滲透壓過低、過高都會(huì)導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡。不同的微生物具有不同的耐受滲透壓程度范圍，所以耐受滲透壓能力也是評(píng)價(jià)微生物菌種優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)鼠李糖乳桿菌XX-11 在不同的鹽度范圍內(nèi)的生長(zhǎng)情況如表1所示。

表1 鼠李糖乳桿菌XX-11在不同鹽度下生長(zhǎng)情況

由表1 可知，鼠李糖乳桿菌XX-11 在NaCl 質(zhì)量濃度為10～65 g/l 范圍內(nèi)生長(zhǎng)情況良好，可耐受NaCl質(zhì)量濃度為70～80 g/l，但生長(zhǎng)緩慢，高于85 g/l的NaCl質(zhì)量濃度則無法正常生長(zhǎng)。該研究結(jié)果與辛羚等[17]對(duì)乳酸菌耐鹽度的研究基本一致，進(jìn)一步說明鼠李糖乳桿菌能耐受高鹽度的環(huán)境。

2.2 菌株適宜生長(zhǎng)溫度

有研究表明[26]鼠李糖乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍在30～40 ℃。本研究結(jié)果顯示（圖1），鼠李糖乳桿菌XX-11 在25～40 ℃溫度區(qū)間都能良好生長(zhǎng)，45 ℃鼠李糖乳桿菌XX-11 生長(zhǎng)受抑制。在溫度35 ℃、40 ℃培養(yǎng)時(shí)，0～4 h為遲緩期，4～16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。這與陳佩等[18]、羅素賢等[27]、劉穎等[28]的研究結(jié)果基本相符。而25 ℃與30 ℃培養(yǎng)時(shí)，0～8 h為遲緩期，8～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與35、40 ℃相比，鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)滯后現(xiàn)象。結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌較適宜生長(zhǎng)溫度為35～40 ℃。

圖1 不同溫度下鼠李糖乳桿菌XX-11的生長(zhǎng)情況

2.3 菌株藥物敏感性

在養(yǎng)殖業(yè)中，隨著抗生素的廣泛使用，從而逐漸導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)。細(xì)菌耐藥性的提高有利有弊，一方面在使用抗生素的同時(shí)，益生菌能在腸道存活，能盡快使腸道菌群達(dá)到平衡，從而降低胃腸道的不適[29-30]。另一方面，有研究表明[31-33]，細(xì)菌耐藥性基因能在微生物菌群間相互傳遞，而使某種病原菌獲得耐藥性，因此菌株耐藥性的安全問題受到極大關(guān)注。在2019 年12 月份實(shí)施的《水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》和《水產(chǎn)動(dòng)物飼用芽孢桿菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定所篩菌株對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物和人類都必須是安全的，無抗生素耐藥性及致病性。所以對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行抗生素耐藥性的測(cè)試顯得極其重要。本研究鼠李糖乳桿菌XX-11對(duì)10種抗生素藥敏紙片敏感性見表2。

由表2 可知，鼠李糖乳桿菌XX-11 對(duì)痢特靈、復(fù)方新諾明與諾氟沙星有一定程度的耐藥性，而對(duì)青霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素與紅霉素等7種藥物表現(xiàn)敏感。這與單曉峰等[34]研究報(bào)道的鯉魚腸道乳酸菌對(duì)慶大霉素耐藥，何亞婷等[35]從鯽魚分離出來的鼠李糖乳桿菌對(duì)四環(huán)素與紅霉素耐藥以及團(tuán)頭魴分離出來的鼠李糖乳桿菌對(duì)紅霉素耐藥等研究結(jié)果不同。這表明，不同來源益生菌如鼠李糖乳桿菌對(duì)藥物的敏感性差異較大。

表2 鼠李糖乳桿菌XX-11對(duì)10種藥敏紙片的敏感性

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

有研究表明[36]鼠李糖乳桿菌能產(chǎn)生對(duì)其他革蘭氏陰性或陽(yáng)性的病原菌具有抑制作用的細(xì)菌素，它具有蛋白質(zhì)部分性質(zhì)，但對(duì)熱與酸具有良好的穩(wěn)定性[37]，能較好地保持活性。本研究培養(yǎng)48 h 的鼠李糖乳桿菌XX-11及培養(yǎng)上清液對(duì)枯草芽孢桿菌等10株指示菌的抑菌結(jié)果如表3所示。

由表3可知，鼠李糖乳桿菌XX-11及其48 h培養(yǎng)上清液對(duì)枯草芽孢桿菌等10 株指示菌都有抑制，但前者對(duì)10 株指示菌的抑制效果差異不明顯，而上清液對(duì)弧菌類病原菌表現(xiàn)出極敏感。此外，鼠李糖乳桿菌XX-11 培養(yǎng)上清液的抑菌效果均較菌體抑菌效果好，這可能是起抑菌作用的主要是代謝產(chǎn)物，且最關(guān)鍵抑菌成分可能是代謝產(chǎn)物中的細(xì)菌素[39-41]。

表3 鼠李糖乳桿菌XX-11及培養(yǎng)上清液對(duì)10株指示菌的抑菌效果

2.5 菌株耐酸性

有報(bào)道[42-43]鼠李糖乳桿菌能耐膽酸及有效黏附于腸道中，本研究通過配置人工胃液，鼠李糖乳桿菌XX-11在不同pH值條件下處理其存活率如表4所示。

由表4可知，鼠李糖乳桿菌XX-11在pH值2.0經(jīng)過1 h 后存活率僅為1.6%，2 h 為0%；而在pH 值2.5、pH 值3.0 的條件下，經(jīng)過1 h 后存活率超過99%，2 h后仍有很高的存活率，分別為85.8%和99.4%。鼠李糖乳桿菌XX-11 在pH 值3.0 經(jīng)過4 h 存活率達(dá)到86.4%，6 h 后存活率達(dá)到68.5%。這與陳佩等[18]的研究在pH 值3.0 處理3 h 存活率大于80%的結(jié)果一致。這說明鼠李糖乳桿菌在沒有營(yíng)養(yǎng)的條件下能在胃蛋白酶及酸性pH 值2.5 共同作用情況下還能有良好的存活率，能通過胃消化從而大部分菌體進(jìn)入腸道。

表4 鼠李糖乳桿菌XX-11對(duì)人工胃液耐受性結(jié)果

2.6 菌株耐膽鹽性

小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[11]，食物在小腸中停留時(shí)間為1～4 h。鼠李糖乳桿菌要定植于小腸，這就要求鼠李糖乳桿菌能耐受一定濃度的膽汁，而對(duì)人體益生菌的膽鹽耐受試驗(yàn)，推薦膽鹽濃度在0.15%～0.3%[44]。因此，本試驗(yàn)采用豬膽鹽濃度為0.3%、0.5%、0.7%，在37 ℃條件下保溫至6 h，通過檢測(cè)活菌數(shù)來確定其存活率，結(jié)果如表5所示。

表5 鼠李糖乳桿菌XX-11對(duì)豬膽鹽耐受性結(jié)果

通過表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，鼠李糖乳桿菌XX-11在豬膽鹽濃度在0.3%與0.5%經(jīng)過37 ℃處理6 h其存活率基本變化不大，存活率皆高于99%以上，這與Haar?man 等[45]的研究較為一致。當(dāng)豬膽鹽濃度提高至0.7%時(shí)，0.5 h 后鼠李糖乳桿菌XX-11 的存活率下降至89.4%，但延長(zhǎng)至6 h 時(shí)其存活率變化不大，均在85%以上。這說明本研究中的鼠李糖乳桿菌XX-11能耐受較高的豬膽鹽濃度，可在小腸內(nèi)存活。

2.7 菌株的安全性

鼠李糖乳桿菌XX-11在MRS液體培養(yǎng)基24 h后，將培養(yǎng)物添加到小鼠飲水中（終濃度為108cfu/ml），連續(xù)喂養(yǎng)10 d 后，對(duì)照組及試驗(yàn)組小鼠均健康活潑、無異常表現(xiàn)。剖檢未見任何器官、消化道出現(xiàn)病變。這表明鼠李糖乳桿菌XX-11對(duì)小鼠安全無毒副作用。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)仿刺參源鼠李糖乳桿菌XX-11 的部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示該菌株能耐高鹽度、胃酸與高膽鹽，且對(duì)多種抗生素敏感；通過抑菌試驗(yàn)與小鼠安全性試驗(yàn)表明，該菌株及其培養(yǎng)液能抑制指示菌特別是水產(chǎn)病原菌生長(zhǎng)，且對(duì)小鼠無毒副作用。以上結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌XX-11既符合微生態(tài)制劑的要求，又符合《水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》的要求，使用安全，可作為水產(chǎn)（如海參）、畜禽動(dòng)物飼料添加的益生菌，甚至在開發(fā)乳酸菌產(chǎn)品功能方面與水產(chǎn)、畜禽動(dòng)物保健方面具有廣闊的應(yīng)用前景。