高效液相色譜法測(cè)定保健食品中褪黑素含量不確定度的評(píng)估

李珍妮 曾文祥

摘 要：本文根據(jù)GB/T 5009.170-2003《保健食品中褪黑素含量的測(cè)定》，即通過高效液相色譜法多次測(cè)量保健品中褪黑素的含量，建立數(shù)學(xué)模型。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程分析其中各種不確定度的來源，包括重復(fù)測(cè)定樣品產(chǎn)生的相對(duì)不確定度、校準(zhǔn)曲線引起的相對(duì)不確定度、試樣質(zhì)量的相對(duì)不確定度、試樣最終定容體積的相對(duì)不確定度。最后綜合各種不確定度因素，評(píng)估測(cè)定褪黑素的不確定度的水平。

關(guān)鍵詞：褪黑素;高效液相色譜法;不確定度

Abstract：This article passed GB/T 5009.170-2003 “Determination of Melatonin Content in Health Foods”， that is， multiple measurements of melatonin content in health products by high performance liquid chromatography to establish a mathematical model. According to the experimental process， the sources of various uncertainties were analyzed， including the relative uncertainty caused by repeated determination of samples， the relative uncertainty caused by calibration curve， the relative uncertainty of sample mass， and the relative uncertainty of final volume of sample. Finally， the uncertainty level of melatonin was evaluated by integrating various uncertainty factors.

Key words：Melatonin; HPLC; Uncertainty

中圖分類號(hào)：R155.5

褪黑素具有小劑量作用強(qiáng)、毒性低、無成癮性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛接受和使用[1]。實(shí)驗(yàn)室有必要開展褪黑素含量檢測(cè)以判定產(chǎn)品是否符合要求。對(duì)于第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，不確定度測(cè)量是質(zhì)量控制的一部分，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)識(shí)別測(cè)量不確定度的貢獻(xiàn)[2]。對(duì)檢測(cè)和校準(zhǔn)結(jié)果測(cè)量不確定度來源的識(shí)別應(yīng)從分析測(cè)量過程入手，即對(duì)測(cè)量方法、測(cè)量系統(tǒng)和測(cè)量程序作詳細(xì)研究[3]。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

評(píng)估高效液相色譜法測(cè)定保健食品中褪黑素含量的不確定度。

2 測(cè)定方法

2.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），電子天平，褪黑素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，一級(jí)水。

2.2 方法依據(jù)

國家標(biāo)準(zhǔn)《保健食品中褪黑素含量的測(cè)定》

（GB/T 5009.170-2003）。

2.3 試樣溶液制備

精確稱量一粒片劑或膠囊于100 mL容量瓶中，以70%乙醇溶解后，超聲波提取10 min。將提取液離心至澄清，取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，以流動(dòng)相定容至刻度線，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)測(cè)試。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取31.8 mg褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）于100 mL

容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得到濃度為316 μg·mL-1的褪黑素標(biāo)準(zhǔn)母液。然后稀釋至7.91、15.8、31.6、63.2 μg·mL-1和158 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.5 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇+水+三氟乙酸=45+55+0.05;流速1.0 mL·min-1;柱溫為室溫;進(jìn)樣量10 μL;色譜柱Symmetry C18，150 mm×3.9 mm，5 μm;檢測(cè)波長222 nm。

3 數(shù)學(xué)模型

褪黑素含量的計(jì)算公式為：

（1）

式（1）中，X-試樣中褪黑素含量，單位為mg·kg-1;

c-由校準(zhǔn)曲線得到的測(cè)試液中褪黑素酸含量，單位為μg·mL-1;V-樣品提取液體積，單位為mL;m-所取試樣質(zhì)量，單位為g;f-樣品提取液的稀釋倍數(shù)。

4 不確定度的來源分析

高效液相色譜法測(cè)定保健食品中褪黑素含量的過程中，不確定度來源主要有：①重復(fù)測(cè)定樣品產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（r）。②校準(zhǔn)曲線引起的相對(duì)不確定度urel（cal）。③試樣質(zhì)量的相對(duì)不確定度urel（m）。④試樣最終定容體積的相對(duì)不確定度urel（V）。

5 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定

5.1 重復(fù)測(cè)定樣品產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（r）

在重復(fù)性條件下，對(duì)褪黑素原料樣品進(jìn)行7次測(cè)定，結(jié)果分別為1.015×106、0.946×106、0.976×106、

1.021×106、0.990×106、0.993×106 mg·kg-1和

0.974×106 mg·kg-1，則褪黑素含量的算術(shù)平均值x=0.99×106 mg·kg-1。

單次測(cè)量不確定度：

（2）

測(cè)量平均值的不確定度：

（3）

測(cè)量平均值相對(duì)不確定度：

（4）

5.2 校準(zhǔn)曲線引起的不確定度urel（cal）

5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的相對(duì)不確定度urel（c）

褪黑素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制可能產(chǎn)生不確定度，其來源包括：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引起的不確定度。②標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引起的不確定度。③標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解、定容及稀釋過程產(chǎn)生的不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引起的不確定度。本實(shí)驗(yàn)采用Dr.Ehrenstorfer公司的褪黑素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其證書給出的信息是純度99.5%，不確定度±0.5%，此不確定度可考慮為矩形分布，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（6）

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引起的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量采用Sartorius BT224S電子天平，其檢定證書給出的示值誤差的擴(kuò)展不確定度U為0.3 mg，包含因子k=2，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.15 mg，由于實(shí)際稱量?jī)纱危?皮重），因此稱量0.031 6 g褪黑素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（7）

（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解、定容及稀釋過程產(chǎn)生的不確定度。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解、定容及稀釋過程中，不確定度主要來源于所使用量具體積的不確定度，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度與量具計(jì)量時(shí)溫度不同產(chǎn)生的不確定度。

稱量好的褪黑素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解、定容于100 mL容量瓶，得到標(biāo)準(zhǔn)母液。實(shí)驗(yàn)中使用100 mL容量瓶定容，100 mL容量瓶的相對(duì)不確定度urel（V1）包含兩部分：①容量瓶體積的不確定度。根據(jù)JJG 196-2006的規(guī)定，A類100 mL容量瓶的容量允差為±0.10 mL，按三角分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為。②容

量瓶中溶液的溫度與計(jì)量時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度。因液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度=，以上二項(xiàng)合成，得出100 mL容量瓶的相對(duì)不確定度：

（8）

標(biāo)準(zhǔn)母液由分度吸量管轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶?？紤]標(biāo)準(zhǔn)系列的中間點(diǎn)，1 000 μL移液器轉(zhuǎn)移1 mL

標(biāo)準(zhǔn)母液的相對(duì)不確定度urel（V2）包含兩部分：①1 000 μL

移液器體積的不確定度。根據(jù)移液器（XQJS12022）的校準(zhǔn)證書，其擴(kuò)展不確定度U=0.67 μL，包含因子k=2，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.34 μL。②移液器中溶液的溫度與校準(zhǔn)時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度。因液體的體積膨脹明顯大于移液器本身的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度=，以上二項(xiàng)合成，得出1 000 μL移液器的相對(duì)不確定度：

（9）

吸取的標(biāo)準(zhǔn)母液定容至10 mL。實(shí)驗(yàn)中使用10 mL

容量瓶定容，得到測(cè)試用溶液，10 mL容量瓶的相對(duì)不確定度urel（V3）包含兩部分：①容量瓶體積的不確定度。根據(jù)JJG 196-2006的規(guī)定，A類10 mL容量瓶的容量允差為±0.02 mL，按三角分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為。②容量瓶中溶液的溫度與較正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度，因液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，此處可只需考慮液體。假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度在±5 ℃變化，溫度變化按矩形分布，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，則由溫度變化引起的不確定度，以上二項(xiàng)合成，得出10 mL容量瓶的相對(duì)不確定度：

（10）

以上3項(xiàng)合成，得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解、定容及稀釋過程產(chǎn)生的不確定度：

（11）

將上述三項(xiàng)合成，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（12）

5.2.2 校準(zhǔn)曲線擬合引起的相對(duì)不確定度urel（f）

褪黑素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制：采用標(biāo)準(zhǔn)母液配制標(biāo)

準(zhǔn)系列濃度為7.91、15.8、31.6、63.2μg·mL-1、158 μg·mL-1

的褪黑素工作液，5種濃度的工作液分別上機(jī)測(cè)定3次，濃度與峰面積的對(duì)應(yīng)的關(guān)系見表1。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=60 215x+20 936，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，樣品測(cè)試次數(shù)p=3，總校準(zhǔn)點(diǎn)N=15。

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（13）

式（13）中：x0-測(cè)得的褪黑素含量的估計(jì)值，為31.4 mg·L-1;x-繪制校準(zhǔn)曲線時(shí)已知濃度值的平均值，為55.3 mg·L-1，b-校準(zhǔn)曲線的斜率;SR-峰面積的殘余標(biāo)準(zhǔn)差。

經(jīng)計(jì)算：

（14）

（x0-x）2=571.2（15）

（16）

代入公式后，得到校準(zhǔn)曲線擬合引起的樣品中褪黑素測(cè)試液含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.54 mg·L-1。

因此，校準(zhǔn)曲線擬合引起的相對(duì)不確定度：

urel（f）=0.54/31.4=1.72×10-2（17）

將5.2.1和5.2.2兩項(xiàng)合成，得到校準(zhǔn)曲線引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（18）

5.3 試樣質(zhì)量的相對(duì)不確定度urel（m）

本實(shí)驗(yàn)稱取樣品質(zhì)量用的是賽多利斯BSA224S天平（編號(hào)1148JSS041），根據(jù)天平的檢定證書，其示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.3 mg，包含因子k=2，因此天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.15 mg，由于實(shí)際稱量?jī)纱危?皮重），因此稱量0.031 0 g樣品時(shí)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（19）

5.4 試樣最終定容體積的相對(duì)不確定度urel（V）

樣品是褪黑素原料，其中褪黑素的含量幾乎為100%，其溶解、稀釋定容的過程與標(biāo)準(zhǔn)品相近，其最終定容體積的相對(duì)不確定度的計(jì)算過程也與標(biāo)準(zhǔn)品一致，其結(jié)果可套用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度結(jié)果：

urel（V）=urel（V0）=1.42×10-3（20）

6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合以上計(jì)算，保健品中的褪黑素測(cè)量不確定度來源及數(shù)值見表2。

（21）

7 擴(kuò)展不確定度

取包含因子為k=2，置信水平為95%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度：

U（95）=K×urel=2×2.19×10-2=4.4×10-2（22）

8 結(jié)果報(bào)告

樣品中褪黑素的含量的擴(kuò)展不確定度為（0.99×106±4.4×104）mg·kg-1（包含因子K=2，置信水平為95%），或99%±4.4%。

參考文獻(xiàn)：

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