基于植物油三維熒光光譜的茶油鑒定模型

盧先勇，何文絢，陳昊聰，黃 睿，張燕杰

1. 福建省測(cè)試技術(shù)研究所, 福建 福州 350003 2. 閩江學(xué)院材料與工程系，福建 福州 350108 3. 福建省中國(guó)漆新型材料工程研究中心(閩江學(xué)院), 福建 福州 350108

引 言

高價(jià)植物油有橄欖油、茶油等，低價(jià)植物油如大豆油、玉米油、棕櫚油、棉籽油等。 茶油的脂肪酸組成與被譽(yù)為“黃金液體”的橄欖油相似，有著“東方橄欖油”的美稱[1]，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的優(yōu)質(zhì)食用油之一，在中國(guó)和亞洲一些國(guó)家越來越受歡迎。 一些不法商家在高價(jià)油中摻入低價(jià)油、地溝油等來謀取暴利，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的權(quán)益，也危害了食用者的安全。 建立高效的茶油鑒定方法對(duì)于防止茶油摻偽、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益具有重要意義。 植物油鑒定主要基于對(duì)特征成分如脂肪酸構(gòu)成、甾醇、生育酚檢測(cè)[2-4]進(jìn)行判定。 主要的檢測(cè)方法有熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜、色譜、核磁共振等[5]。 近年來也發(fā)展了化學(xué)計(jì)量學(xué)方法與上述檢測(cè)方法結(jié)合的植物油鑒定技術(shù)。 熒光光譜靈敏度高，選擇性強(qiáng)。 植物油的主要熒光物質(zhì)是不飽和脂肪酸、維生素E和色素[6]。 方曉明等[7]利用同步熒光光譜儀在250～720 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，采集分析了多種摻雜特級(jí)初榨橄欖油的同步熒光光譜圖，研究結(jié)果顯示： 依據(jù)同步熒光光譜能將大部分摻雜特級(jí)初榨橄欖油與橄欖油區(qū)分，但由于大豆油與特級(jí)初榨橄欖油的同步光譜基本相同，該法無法鑒別摻入大豆油的摻假橄欖油。 三維熒光光譜描述了熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系，因此能完整地描述物質(zhì)的熒光特征。 方惠敏和黃秀麗等分別對(duì)多種植物油的同步熒光光譜和三維熒光光譜進(jìn)行了分析研究，研究結(jié)果表明： 三維圖譜具有指紋識(shí)別能力，比同步熒光光譜提供的信息更加直觀，但三維熒光光譜除了與植物油品種有關(guān)外，還與植物油加工工藝、果實(shí)原料來源等因素有很大關(guān)系。 多個(gè)研究表明： 植物油脂中的熒光物質(zhì)具有高度相似性，本研究團(tuán)隊(duì)研究了多品牌茶油、大豆油、玉米油以及摻偽茶油的三維熒光光譜，發(fā)現(xiàn)很難通過觀察三維熒光光譜直觀地區(qū)別茶油與其摻偽油。 三維熒光光譜的指紋識(shí)別能力，對(duì)于植物油鑒定，有明顯優(yōu)勢(shì)，一些學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用熒光光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)植物油的分類及摻雜進(jìn)行了研究[8]，其中平行因子分析法(PARAFAC)是目前最常用的三維熒光光譜數(shù)據(jù)分析方法[9]。 考慮到摻假茶油與茶油的三維熒光光譜差異較小，PARAFAC數(shù)據(jù)分析方法還有不足，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。 瑞典Umetrics公司開發(fā)的一款多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA，其最新版本SIMCA15.0.2中的Orthogonal partial least squares discriminate analysis(OPSL-DA)非常適合于植物油類別鑒定。 本研究利用自編小程序，將三維熒光的二維函數(shù)表達(dá)轉(zhuǎn)換成一維函數(shù)表達(dá)，嘗試用這種新的方法表達(dá)三維熒光光譜數(shù)據(jù)，在SIMCA15.0.2軟件平臺(tái)上，利用OPSL-DA構(gòu)建特異性、敏感性符合實(shí)際應(yīng)用要求的茶油鑒定模型，為基于植物油三維熒光光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建植物油快速鑒定模型，提供了一種新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑、樣本

F-4600型熒光分光光度計(jì)，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司； 石油醚30～60 ℃(分析純)，常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司。

(1)訓(xùn)練集樣本： 54個(gè)訓(xùn)練集樣本都購(gòu)于大型超市，其中14個(gè)品牌茶油的17個(gè)樣本(購(gòu)自福建、江西、廣西、浙江； 制作工藝全部是壓榨)； 10個(gè)品牌玉米油的19個(gè)樣品(購(gòu)自黑龍江、廣東、福建、甘肅、陜西、河南等六個(gè)省份； 制作工藝全部是壓榨； 19個(gè)玉米油樣本中14個(gè)樣本標(biāo)注非轉(zhuǎn)基因，5個(gè)樣本未標(biāo)注非轉(zhuǎn)基因)； 11個(gè)品牌大豆油的19個(gè)樣品(購(gòu)自黑龍江、山東、福建、吉林、陜西、河南等六個(gè)省份； 9個(gè)壓榨，10個(gè)浸出； 10個(gè)樣本標(biāo)注轉(zhuǎn)基因，9個(gè)樣本標(biāo)注非轉(zhuǎn)基因)。 以上這些植物油樣本，經(jīng)氣相色譜(GB/T 17377—2008)驗(yàn)證，其脂肪酸組成都符合相應(yīng)植物油的中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 訓(xùn)練集樣本概況見表1。

表1 訓(xùn)練集樣本概況Table 1 Training set sample overview

(2)檢驗(yàn)集樣本： 27個(gè)檢驗(yàn)集樣本包括7個(gè)購(gòu)于大型超市且與訓(xùn)練集樣本非同品牌同批次的茶油樣本； 18個(gè)摻偽茶油樣本，它們是以茶油為主體油，在實(shí)驗(yàn)室中分別摻入大豆油、玉米油、棕櫚油、棉籽油、混合油1(由大豆油、棕櫚油、棉籽油、玉米油按1∶1∶1∶1體積比混合)和混合油2(由大豆油∶玉米油∶花生油按1∶1∶1體積比混合)，配制成摻偽濃度分別為4%，10%和16%(體積比)的摻偽茶油； 2個(gè)購(gòu)于鄉(xiāng)村小店的盲樣(Camellia-rural-1和Camellia-rural-2)，這兩個(gè)盲樣經(jīng)氣相色譜鑒定，它們的脂肪酸構(gòu)成不符合茶油設(shè)定值，是假茶油。

1.2 方法

1.2.1 植物油樣本熒光光譜采集

10 mm石英樣品池用石油醚清洗干凈，加入約1 mL植物油樣。 熒光光譜采集實(shí)驗(yàn)參數(shù)： 激發(fā)波長(zhǎng)范圍200～580 nm，間隔10 nm； 發(fā)射波長(zhǎng)范圍250～700 nm，間隔10 nm； 掃描速度2 000 nm·min-1； 激發(fā)狹縫10 nm； 發(fā)射狹縫10 nm； 光電倍增管電壓400 V； 響應(yīng)時(shí)間0.5 s。

1.2.2 熒光光譜數(shù)據(jù)獲取

(1)樣本熒光光譜數(shù)據(jù)設(shè)定： 激發(fā)位置數(shù)=(580-200)÷10=38(個(gè))，構(gòu)成矩陣橫坐標(biāo)； 發(fā)射位置數(shù)=(700-250)÷10=45(個(gè))，構(gòu)成矩陣縱坐標(biāo)。 由此條件獲取樣本熒光光譜矩陣二元數(shù)據(jù)集，共有對(duì)應(yīng)激發(fā)-發(fā)射位置變量值=38×45=1 710個(gè)。

(2)通過SAS 9.4版軟件編程方法，將樣本熒光光譜矩陣數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)化為1 710個(gè)變量值的一元數(shù)據(jù)集。 主要程序模塊：

①按樣本矩陣橫坐標(biāo)的激發(fā)位置數(shù)分解數(shù)據(jù)集，本案例生產(chǎn)38個(gè)分解數(shù)據(jù)集。

②將樣本上述分解數(shù)據(jù)集，追加匯總，再轉(zhuǎn)換為一元關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 茶油鑒定模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

將各集樣本數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)metrics SIMCA15.0.2軟件。 采用OPLS-DA算法，基于訓(xùn)練集樣本構(gòu)建茶油鑒定模型。 根據(jù)訓(xùn)練集樣本茶油類別得分值，設(shè)定茶油得分值范圍。 然后依據(jù)該模型預(yù)測(cè)檢驗(yàn)集樣本分值，基于檢驗(yàn)集樣本的預(yù)測(cè)結(jié)果，獲取模型特異性及敏感性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 各集樣品設(shè)計(jì)

各種植物油主要成分相似，大豆油和玉米油的價(jià)格相對(duì)較為低廉，是最可能的摻偽茶油摻雜物。 因此，訓(xùn)練集樣本由茶油、大豆油、玉米油三類植物油構(gòu)成。 考慮到植物油的成分除了與其種類有關(guān)，還與植物的種植地和植物油的加工工藝有關(guān)。 多個(gè)品牌大豆油樣本、購(gòu)買地點(diǎn)涵蓋我國(guó)東南、東北、西北、華中，加工工藝包含壓榨與浸提這兩種大豆油主要加工工藝，還包含10個(gè)轉(zhuǎn)基因與9個(gè)非轉(zhuǎn)基因樣本； 多個(gè)品牌玉米油樣本、購(gòu)買地點(diǎn)涵蓋我國(guó)東南、東北、西北、華中，19個(gè)加工工藝是壓榨，14個(gè)標(biāo)注非轉(zhuǎn)基因，5個(gè)未標(biāo)注； 市面上茶油都是采用壓榨工藝得到的，所以茶油只有壓榨工藝的樣本，一般南方較多使用茶油，北方很少使用，多個(gè)品牌茶油購(gòu)買地點(diǎn)都在南方。 經(jīng)過以上設(shè)計(jì)的樣本能較好地代表大豆、玉米、茶油。 模型特異性與敏感性數(shù)據(jù)來源于檢驗(yàn)集的測(cè)試結(jié)果。 檢驗(yàn)集樣本與實(shí)際越符合，相關(guān)的數(shù)據(jù)越有代表性。 摻偽茶油通常是在茶油中摻入低價(jià)油或它們的混合油，分別選取大豆油、玉米油、棕櫚油、棉籽油以及這四種低價(jià)油按等體積比混合得到混合油1，花生油是我國(guó)使用量最大的植物油之一，廚余油中花生油可能性大，因此選取大豆油、玉米油、花生油按等體積比混合得到混合油2，以上油添加到茶油中，配制成三個(gè)(4%，10%和16%)摻偽水平共18份摻偽茶油樣本。 此外，在摻偽相對(duì)嚴(yán)重的鄉(xiāng)村小店購(gòu)買2個(gè)茶油命名為Camellia-rural-1和Camellia-rural-2。 再加上7個(gè)不同品牌的茶油(保證其與訓(xùn)練集茶油樣本非同品牌同批次)。 這樣，檢驗(yàn)集中共有27個(gè)樣本，如此設(shè)計(jì)的檢驗(yàn)集樣本能很好地代表目前植物油市場(chǎng)中茶油及摻偽茶油。

2.2 植物油三維熒光譜圖分析

圖1為訓(xùn)練集中某個(gè)茶油、大豆油、玉米油樣本的熒光等高線圖，由圖1可知茶油、大豆油、玉米油樣本譜圖相似，三者比較，茶油沒有明顯的特征。 圖2為茶油、添加6%低價(jià)混合油1的摻偽茶油、添加12%玉米油的摻偽茶油的三維熒光譜圖，由圖2可知添加12%玉米油的摻偽茶油與茶油的譜圖幾乎相同，添加6%低價(jià)混合油1的摻偽茶油與茶油譜圖有差異。 圖3為三個(gè)品牌茶油的熒光等高線圖，其中福建沈郎鄉(xiāng)茶油(a)與廣西巴馬茶油(c)顏色較淺是經(jīng)過精煉的茶油，福建豐達(dá)牌茶油(b)顏色深是未精煉的，其譜圖在色素位置有較強(qiáng)熒光峰，圖3提示不同品牌茶油的熒光等高線圖有差異，由于加工工藝不同或植物產(chǎn)地不同導(dǎo)致不飽和脂肪酸、生育酚、色素等類別熒光物質(zhì)的構(gòu)成不同，使得茶油樣本之間三維熒光光譜有差異。 茶油、玉米油、大豆油最強(qiáng)熒光峰位置見表2。 表2 的17個(gè)茶油樣本中有3個(gè)樣本含有兩個(gè)較強(qiáng)熒光峰，這3個(gè)樣本都是顏色較深的未精煉茶油，其他14個(gè)樣本是經(jīng)過精煉的茶油只有一個(gè)較強(qiáng)峰。 總結(jié)圖1、圖2、圖3以及表2得出： ①茶油與玉米油尤其大豆油的譜圖差異小； ②添加12%玉米油的摻偽茶油其譜圖與茶油基本相同； ③不同加工工藝的茶油其譜圖有較大差異。 本文收集了大量樣本，樣本涵蓋不同加工工藝、不同植物種植地，與已發(fā)表的文獻(xiàn)相比，較全面地展示了三類植物油的三維熒光譜。 通過以上分析結(jié)果，可以得出僅通過觀察樣本的三維熒光譜很難進(jìn)行茶油鑒定。

圖1 茶油(c)、大豆油(b)、玉米油(a)熒光等高線Fig.1 Camellia oil (c)，soybean oil (b)，corn oil (a) fluorescence contour

圖3 沈郎鄉(xiāng)茶油(c)、豐達(dá)茶油(b)、巴馬茶油(a)熒光等高線Fig.3 Fluorescence contours of Shenlang Xiang Camellia oil (c)，F(xiàn)engda Camellia oil (b)， Bama Camellia oil (a)

表2 茶油、玉米油、大豆油最強(qiáng)熒光峰位置及其強(qiáng)度值

2.3 基于三維熒光光譜數(shù)據(jù)的茶油鑒定模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

為了更好地應(yīng)用三維熒光光譜鑒定茶油, 引入化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。 三維熒光光譜的數(shù)據(jù)是以 EEM矩陣表達(dá)，表征了特定激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)位置處的熒光強(qiáng)度。 每個(gè)樣本用二元函數(shù)z=f(EI，EM)表達(dá)。 本研究探究用一元函數(shù)z=f(EI-EM)來表達(dá)樣本三維熒光光譜，在此基礎(chǔ)上在SIMCA15.0.2軟件平臺(tái)上應(yīng)用OPLS-DA方法構(gòu)建茶油鑒定模型。 為此，編寫了小程序，在SAS軟件平臺(tái)運(yùn)行該小程序?qū)⒍瘮?shù)z=f(EI，EM)轉(zhuǎn)換成一元函數(shù)z=f(EI-EM)，每個(gè)樣本用一維數(shù)據(jù)表示。 這樣可用矩陣數(shù)據(jù)來表達(dá)各集樣本，矩陣中第一行是EX200-EM250 EX200-EM260 EX200-EM270 … EX200-EM700 EX210-EM250 EX210-EM260 EX210-EM270 … EX210-EM700第一行的最后是EX580-EM250 EX210-EM250 EX580-EM260 EX580-EM270 … EX580-EM700共1 710個(gè)(EX***-EM***)位置值，第一列是樣本號(hào)，其他單元格數(shù)值是各樣本在對(duì)應(yīng)位置的熒光強(qiáng)度值。 將訓(xùn)練集樣本矩陣數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA15.0.2軟件中，采用OPLS-DA構(gòu)建茶油鑒定模型。 圖4為OPLS-DA模型的二維得分圖，圖4顯示茶油區(qū)域與大豆油、玉米油區(qū)域距離較遠(yuǎn)，茶油可以很好地與玉米油、大豆油區(qū)分，玉米油區(qū)域與大豆油區(qū)域很接近。 模型關(guān)鍵參數(shù)如圖5，由圖5可知代表擬合能力的參數(shù)R2=0.84； 代表預(yù)測(cè)能力的參數(shù)Q2=0.72，變量數(shù)=2，提示該模型是一個(gè)優(yōu)秀的模型。 訓(xùn)練集樣本中茶油在其類別的得分值都在0.70～1.15范圍，因此將該得分值范圍定為茶油的設(shè)定值。 用該模型對(duì)檢驗(yàn)集樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果見表3。 表3顯示模型對(duì)檢驗(yàn)集樣本的7個(gè)茶油得分值都在0.70～1.15范圍，判定為茶油，判定結(jié)果全部正確； 摻偽茶油包括摻偽水平只有4%的混合油1、混合油2的摻偽茶油，它們的分值都不在0.70～1.15范圍，判定為非茶油或摻假茶油，判定結(jié)果也全部正確； 兩個(gè)購(gòu)買于鄉(xiāng)村小店的茶油分值不在0.70～1.15范圍，判定為非茶油或摻假茶油，經(jīng)過氣相色譜分析，這兩個(gè)樣本的油酸及亞油酸濃度都不符合茶油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 11765—2018 油茶籽油)規(guī)定的設(shè)定值，是偽茶油，證明模型判定結(jié)果是正確的。 模型的特異性、敏感性及其水平數(shù)據(jù)見表4。 模型的主要參數(shù)值及檢驗(yàn)集樣本的預(yù)測(cè)結(jié)果都表明，用本文首次提出的一維函數(shù)表達(dá)的三維熒光光譜結(jié)合正交偏最小二乘判別分析，可以構(gòu)建特異性、敏感性符合實(shí)際要求的茶油鑒定模型。 目前最通用的三維熒光光譜數(shù)據(jù)降維、提取方法是平行因子法，其處理數(shù)據(jù)時(shí)收斂非常慢，完成三維熒光譜的數(shù)據(jù)分析需要太長(zhǎng)的程序； 此外需要精確的估計(jì)組分?jǐn)?shù)，否則將導(dǎo)致模型產(chǎn)生很大偏差[10-11]，由于本文研究的茶油鑒定模型對(duì)檢驗(yàn)集27個(gè)樣本的預(yù)測(cè)全部正確，且對(duì)摻入與茶油脂肪酸構(gòu)成極為相似的玉米油、大豆油以及各種混合油，摻入量4%即可檢出； 對(duì)于兩個(gè)盲樣的預(yù)測(cè)結(jié)果也是正確的，說明用一元函數(shù)z=f(EI-EM)替代目前通用的二元函數(shù)z=f(EI，EM)來表征三維熒光數(shù)據(jù)，既簡(jiǎn)單、方便又可以很好地體現(xiàn)茶油的類別特征，結(jié)合正交偏最小二乘判別分析，可以構(gòu)建符合市場(chǎng)要求的茶油鑒定模型。

圖4 訓(xùn)練集樣本二維得分圖 紅色玉米油； 藍(lán)色大豆油； 綠色茶油Fig.4 Two-dimensional score map of training set samples red corn oil； blue soybean oil； green tea oil

表3 檢驗(yàn)集樣本茶油類別得分值Table 3 Camellia oil category score valuesof the samples in test set

表4 OPLS-DA茶油鑒定模型特異性、敏感性及其水平Table 4 Specificity, sensitivity and its level of camellia oilidentification model (OPLS-DA)

3 結(jié) 論

通過編寫小程序?qū)颖救S熒光光譜的二維函數(shù)表達(dá)轉(zhuǎn)換成一維函數(shù)表達(dá)，形成訓(xùn)練集、檢驗(yàn)集樣本數(shù)據(jù)矩陣，再結(jié)合正交偏最小二乘判別分析，構(gòu)建基于植物油三維熒光光譜數(shù)據(jù)的茶油鑒定模型，該模型對(duì)27個(gè)檢驗(yàn)集樣本的鑒定結(jié)果全部正確，能夠鑒別添加量?jī)H為4%，且摻雜物主要成分與茶油非常相似的(如玉米油、大豆油、混合油)摻偽茶油，為應(yīng)用植物油三維熒光光譜進(jìn)行快速植物油鑒定，提供了一種新的思路。 與現(xiàn)有的平行因子數(shù)據(jù)處理方法相比，本文建立的處理方法，過程簡(jiǎn)單、模型預(yù)測(cè)效果好，但在解釋各成分貢獻(xiàn)方面不如平行因子法。 本法適用于篩查摻偽植物油，不適用于分析摻偽量及其摻偽成分。 今后將通過分析更多的植物油種類，探究有效數(shù)據(jù)區(qū)域，進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域。