高光譜成像的腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)

宋 楠，郭漢洲，沈春洋，孫 慈，楊 晉，張金男

1. 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033 2. 長(zhǎng)春國(guó)科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130033 3. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130033

引 言

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤，發(fā)病位置的特殊性使其致殘、致死率高，患者預(yù)后極差[1-2]。 目前最成熟的治療方法為手術(shù)切除。 但由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性侵襲性生長(zhǎng)，與周圍的正常腦組織不存在明顯的邊界，故最大程度的切除腫瘤區(qū)域的同時(shí)保護(hù)正常腦組織是手術(shù)中的一個(gè)難題[3]。 目前常用的術(shù)中輔助技術(shù)主要包括超聲、CT、核磁共振等。 但這些方法有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不能實(shí)時(shí)定位、存在毒副作用和設(shè)備價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，且往往依賴醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)判斷[4]。 因此，本工作嘗試采用高光譜成像技術(shù)作為術(shù)中輔助診斷的一種新手段。

目前，高光譜成像技術(shù)在地質(zhì)勘測(cè)、土壤植被生態(tài)監(jiān)測(cè)、海洋檢測(cè)等方面取得了豐富的研究成果。 隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)。 高光譜成像技術(shù)將光譜和圖像合并，形成包含二維空間圖像數(shù)據(jù)與一維光譜數(shù)據(jù)的三維數(shù)據(jù)立方體，不僅能獲取物體的空間信息，還能獲得圖像上每個(gè)像素點(diǎn)的光譜信息以分析物體的內(nèi)部屬性。 高光譜成像技術(shù)具備精確、快速、高靈敏度、非接觸、無損傷、高安全性等特點(diǎn)，符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展要求[5]。 目前，高光譜成像技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于視網(wǎng)膜情況檢測(cè)和癌癥檢測(cè)等領(lǐng)域，西班牙拉斯帕爾馬斯大學(xué)(ULPGC)對(duì)腦膠質(zhì)瘤病理切片的光譜特征展開了相關(guān)研究[6]，國(guó)內(nèi)的第三軍醫(yī)大學(xué)開展了小鼠植入腦膠質(zhì)瘤的光譜特征研究。

本文采用將自行研制的高光譜成像儀，將其與顯微鏡結(jié)合，采集腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部的高光譜成像數(shù)據(jù)，對(duì)正常組織區(qū)域和腫瘤組織區(qū)域的光譜特征進(jìn)行分析，為高光譜成像技術(shù)在腦外科手術(shù)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 系統(tǒng)組成與工作原理

將自行研制的高光譜成像儀與吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院提供的奧林巴斯BX51顯微鏡和蔡司S5手術(shù)顯微鏡相結(jié)合，如圖1所示。 采集腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部的高光譜成像數(shù)據(jù)以及相關(guān)H&E染色病理切片數(shù)據(jù)，并利用自主編寫的光譜數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)采集結(jié)果進(jìn)行分析。 該系統(tǒng)包含顯微鏡、棱鏡-光柵(PG)分光模塊、高分辨率CCD相機(jī)、推掃機(jī)構(gòu)、控制計(jì)算機(jī)等組成。 光譜采集范圍為400～1 000 nm，光譜分辨率優(yōu)于2.8 nm，可采集270個(gè)波段的光譜數(shù)據(jù)，圖像尺寸為7.8 mm×14.2 mm[7]。

為了實(shí)現(xiàn)圖像數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)的同時(shí)采集，本系統(tǒng)采用面陣探測(cè)器接收的推掃方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。 CCD每幀采集的圖像為： 沿狹縫方向一維成景物的空間像，垂直于狹縫方向一維為空間各像元的光譜數(shù)據(jù)。 令電機(jī)垂直于狹縫方向運(yùn)動(dòng)，CCD同時(shí)進(jìn)行采集。 將CCD采集的單幀圖像融合得到一副完整的物質(zhì)圖像數(shù)據(jù)，同時(shí)獲得圖像中每個(gè)像元的光譜數(shù)據(jù)。 這樣就得到了一個(gè)完整的包含圖像數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)的物質(zhì)數(shù)據(jù)立方體[8]。

圖1 高光譜成像系統(tǒng)(a)： 高光譜成像儀與顯微鏡結(jié)合； (b)： 高光譜成像儀與手術(shù)顯微鏡結(jié)合Fig.1 Hyperspectral imaging system(a)： Hyperspectral imager combined with a microscope； (b)： Hyperspectral imager combined with a operating microscope

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料

所使用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液、無胸腺裸小鼠和標(biāo)準(zhǔn)H&E染色病理切片均由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院提供，其中無胸腺裸小鼠體重15～20 g，鼠齡5～7周，飼養(yǎng)于無菌凈化室內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院審批，并符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》要求。

2.2 動(dòng)物模型制作

共取8只無胸腺裸小鼠，建立人腦膠質(zhì)瘤裸小鼠腦內(nèi)原位移植動(dòng)物模型，分別經(jīng)20%水合氯醛吸入麻醉后，俯臥位固定頭顱，酒精消毒皮膚，在裸小鼠額部距顱中線右側(cè)2.5 mm，冠狀縫前1 mm處先用直徑1 mm的牙科鉆小心鉆穿顱骨，然后用吸有瘤細(xì)胞懸液的微量進(jìn)樣器經(jīng)孔垂直進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中，進(jìn)針深度為針尖距顱骨表面3.5 mm，注射前將針稍微回退0.5～1 mm，緩慢注入，除針前停留2 min。 接種部位為裸小鼠右側(cè)大腦尾狀核。 腫瘤接種后19 d對(duì)裸小鼠進(jìn)行MRI檢查，確認(rèn)其顱內(nèi)腫瘤形成。

2.3 高光譜成像

每次進(jìn)行高光譜成像數(shù)據(jù)采集前要采集環(huán)境暗噪聲和標(biāo)準(zhǔn)漫反射率板的成像光譜數(shù)據(jù)，作為高光譜成像數(shù)據(jù)的校正依據(jù)[9]。 整個(gè)數(shù)據(jù)采集過程保持在室溫22 ℃、恒定暗光照條件進(jìn)行，依次對(duì)每只腦膠質(zhì)瘤小鼠進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。 首先，將腦膠質(zhì)瘤小鼠麻醉后，俯臥位固定于立體定向儀底板上，在手術(shù)顯微鏡下沿中線剪開約2 cm，顱骨鉆孔形成圓形骨窗，暴露腫瘤表面。 其次，調(diào)節(jié)搭載高光譜成像儀的手術(shù)顯微鏡，使得腫瘤位于顯微鏡視野中心，利用高光譜成像儀采集腫瘤的高光譜成像數(shù)據(jù)，每隔1分鐘采集一組，共采集5組數(shù)據(jù)。 并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中。

數(shù)據(jù)采集完成后，立即完整取出腦組織及腫瘤組織，固定于4%多聚甲醛中，24 h后進(jìn)行石蠟包埋處理，之后制作標(biāo)準(zhǔn)H&E染色切片。 利用搭載高光譜成像儀的顯微鏡進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤染色病理切片的高光譜成像數(shù)據(jù)采集，并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中。

2.4 數(shù)據(jù)處理

光源輻射能量穿透樣本或在樣本表面反射后形成樣本的特征光譜，并為高光譜成像儀所記錄，對(duì)該特征光譜進(jìn)行分析以尋找正常組織與腫瘤組織的光譜差異并以此實(shí)現(xiàn)二者之間的區(qū)分。 為降低噪聲影響，使光譜特征差異顯著化以便于區(qū)分，需要對(duì)所獲取的光譜信息進(jìn)行一定的數(shù)據(jù)處理。

2.4.1 非均勻性校正

對(duì)于本研究使用的高光譜成像儀，探測(cè)器平面的每一行都有一定數(shù)量的探測(cè)單元，對(duì)應(yīng)一個(gè)波段，隨著推掃運(yùn)動(dòng)以行為單位獲取成像光譜數(shù)據(jù)。 對(duì)于一個(gè)波段來說，探測(cè)單元之間存在響應(yīng)不一致的問題，進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)重的條帶噪聲，即圖像列之間的不均勻，影響成像光譜數(shù)據(jù)的后續(xù)處理和應(yīng)用。 不同探測(cè)單元的響應(yīng)函數(shù)會(huì)隨著入射強(qiáng)度變化而不同，因而導(dǎo)致條帶噪聲。 需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非均勻性校正，方法如下：

逐波段對(duì)原始成像光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)矩匹配校正，得到標(biāo)準(zhǔn)矩匹配校正圖像。 計(jì)算方法為

1≤i≤M, 1≤j≤N,i,j∈Z

(1)

以標(biāo)準(zhǔn)矩匹配校正圖像為基礎(chǔ)，選擇相鄰兩列像元中相同像元，對(duì)于某一波段來說，選擇方法為

2≤i≤M, 1≤j≤N,i,j∈Z}

(2)

對(duì)于相鄰兩列原始數(shù)據(jù)，以前一列為基準(zhǔn)，用兩列中相同像元，通過線性回歸得到后一列的校正系數(shù)，計(jì)算方法為

{Ai,Bi}=regress(Di, j,Di-1, j),j∈Φ

(3)

其中，Ai和Bi為校正系數(shù)； regress(·, ·)為線性回歸。 根據(jù)校正系數(shù)對(duì)后一列進(jìn)行校正，順次遍歷一個(gè)波段的所有列，完成一個(gè)波段圖像非均勻性校正。 計(jì)算方法為

(4)

2.4.2 光譜去噪

對(duì)于高光譜成像數(shù)據(jù)而言，去噪需要盡可能保證光譜的形狀。 SG濾波器是一種在時(shí)域內(nèi)基于滑動(dòng)濾波窗口多項(xiàng)式擬合的濾波方法，具有計(jì)算量小，計(jì)算速度快，可以很好地保持波形的相對(duì)極大值、極小值和脈沖寬度等特性，比較適用于光譜去噪。 SG濾波過程如下：

確定濾波窗口和多項(xiàng)式次數(shù)。 根據(jù)高光譜成像儀的采樣特點(diǎn)確定成像光譜數(shù)據(jù)濾波窗口大小及變化范圍，多項(xiàng)式次數(shù)及其變化范圍。

用最小二乘法對(duì)原始成像光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行滑動(dòng)擬合，并求出卷積系數(shù)。 用卷積系數(shù)對(duì)原始成像光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行卷積計(jì)算，完成SG濾波，得到去噪后的成像光譜數(shù)據(jù)。 在2M+1成像光譜數(shù)據(jù)濾波窗口內(nèi)，可以用多項(xiàng)式來擬合波形數(shù)據(jù)，多項(xiàng)式表達(dá)為

(5)

其中，p(n)為多項(xiàng)式；n為2M+1成像光譜數(shù)據(jù)濾波窗口內(nèi)波形數(shù)據(jù)點(diǎn)的位置，-M≤n≤M；k為多項(xiàng)式次數(shù)；ak為多項(xiàng)式系數(shù)。 最小二乘法求出系數(shù)ak就可計(jì)算擬合后的成像光譜數(shù)據(jù)濾波窗口內(nèi)某點(diǎn)的擬合數(shù)值，該數(shù)值作為去噪后的數(shù)值。 按照上述方式，遍歷顯微成像光譜數(shù)據(jù)所有像元。 窗口選擇與儀器噪聲水平有很大關(guān)系，需要結(jié)合數(shù)據(jù)噪聲大小進(jìn)行調(diào)整，噪聲越大窗口越大。 因此，對(duì)于特定儀器窗口相對(duì)較穩(wěn)定，所選擇的去噪窗口大小5。 處理效果如圖2所示。

圖2 光譜去噪處理(a)： 常規(guī)方法去噪處理結(jié)果； (b)： SG濾波法去噪處理結(jié)果Fig.2 Spectral denoising(a)： Noise removal by conventional method； (b)： Noise removal by SG filtering method

2.4.3 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理

無論是反射光譜，還是透射光譜，其特征主要反映在光譜曲線的形狀上。 形狀的差異更有利于區(qū)分不同物質(zhì)的特征光譜。 對(duì)光譜信息進(jìn)行極差標(biāo)準(zhǔn)化處理，可以更加直觀地反映光譜曲線的形狀特征。 光譜極差標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)算公式為

(6)

其中，S(λ)為樣本的反射率或透射率；Smin(λ)為光譜的最小值；Smax(λ)為光譜的最大值。 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理可以有效減弱因光照、暗電流偏移等因素造成的光譜信息系統(tǒng)性誤差。 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理效果如圖3所示。

圖3 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理(a)： 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理前； (b)： 極差標(biāo)準(zhǔn)化處理后Fig.3 Range standardization(a)： Before range standardization； (b)： After range standardization

3 結(jié)果與討論

利用搭載高光譜成像儀的手術(shù)顯微鏡采集腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部成像光譜數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。 圖4為腦膠質(zhì)瘤小鼠在體腦部成像光譜數(shù)據(jù)。

經(jīng)過逐像元的反射率計(jì)算、非均勻性校正和光譜去噪之后，數(shù)據(jù)的條帶噪聲和光譜曲線噪聲基本被消除。 觀察圖4(b)和(c)的光譜曲線，在540～600 nm范圍內(nèi)，非腫瘤腦組織反射光譜呈現(xiàn)“W”狀，而腦膠質(zhì)瘤反射光譜較為平滑，兩種反射光譜存在一定區(qū)別。 這主要是因?yàn)檠褐写嬖趦煞N血紅蛋白，一種為含氧血紅蛋白，吸收峰位于554 nm左右，含氧血紅蛋白含量占總血紅蛋白含量的百分比稱為氧飽和度[10]。 由于腫瘤組織存在快速生長(zhǎng)及血管異常的特點(diǎn)，缺氧是腫瘤細(xì)胞普遍存在的狀態(tài)，腫瘤組織處的脫氧血紅蛋白的含量高于非腫瘤腦組織，導(dǎo)致氧飽和度低于非腫瘤腦組織。 可見，在體狀態(tài)下，腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織在氧飽和度方面存在一定區(qū)別。

圖4 腦膠質(zhì)瘤小鼠在體腦部成像光譜數(shù)據(jù)(a)： 腦膠質(zhì)瘤小鼠在體腦部三色合成圖像； (b)： 非腫瘤腦組織反射光譜曲線； (c)： 腦膠質(zhì)瘤反射光譜曲線； (d)： 腦膠質(zhì)瘤小鼠在體腦部單波段圖像Fig.4 HSI data of the brain in glioma mice(a)： Tricolor composite image of the brain in glioma mice； (b)： Reflectance spectra of non-tumorous brain tissues； (c)： Reflectance spectra of gliomas brain tissues； (d)： Single band images of the brain in glioma mice

利用搭載高光譜成像儀的顯微鏡采集腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部H&E染色病理切片成像光譜數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。 圖5為腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部H&E染色病理切片成像光譜數(shù)據(jù)。

經(jīng)過逐像元的反射率計(jì)算、非均勻性校正和光譜去噪之后，數(shù)據(jù)的條帶噪聲和光譜曲線噪聲基本被消除。 從圖5(c)中可見，H&E染色病理切片中的腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織反射光譜存在一定差別，在530～540 nm范圍內(nèi)反射率有所不同。 H&E染色病理切片中的腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織反射光譜與在體狀態(tài)下的腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織反射光譜相比存在差異，主要原因可能是因?yàn)镠&E染色病理切片中染色劑的存在、染色不均性以及組織離體后細(xì)胞產(chǎn)生變化等，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究與實(shí)驗(yàn)。

圖5 腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部H&E染色病理切片成像光譜數(shù)據(jù)(a)： 非腫瘤腦組織切片圖像和腦膠質(zhì)瘤切片圖像； (b)： 腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織反射光譜曲線Fig.5 HSI data of H&E stained pathological sections of the brain in glioma mice(a)： Pathological section image of non-tumorous brain tisses and pathological section image of gliomas； (b)： Reflectance spectra between gliomas and non-tumorous brain tissues

4 結(jié) 論

將高光譜成像技術(shù)應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)具有可行性。 研制了一臺(tái)高光譜成像儀，在VNIR范圍內(nèi)(400～1 000 nm)共獲取8組腦膠質(zhì)瘤小鼠的高光譜數(shù)據(jù)，每組包含1組腦膠質(zhì)瘤小鼠在體腦部成像光譜數(shù)據(jù)及1組腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部H&E染色病理切片成像光譜數(shù)據(jù)，并通過多種數(shù)據(jù)處理手段對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析和處理。 通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論分析可知，在體狀態(tài)下，腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織在氧飽和度方面存在一定區(qū)別，而H&E染色病理切片中的腦膠質(zhì)瘤與非腫瘤腦組織反射光譜在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的反射率上存在一定差別。 初步表明高光譜成像技術(shù)可區(qū)分腦膠質(zhì)瘤和非腫瘤腦組織，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的檢測(cè)，為今后臨床實(shí)驗(yàn)與腦膠質(zhì)瘤術(shù)中輔助診斷提供依據(jù)和參考。

綜上所述，高光譜成像技術(shù)已被證明可實(shí)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的檢測(cè)，但考慮到人體的復(fù)雜性和個(gè)體的差異性，仍須進(jìn)行進(jìn)一步的研究，如進(jìn)行更多樣本量的成像光譜數(shù)據(jù)采集，建立豐富的腦膠質(zhì)瘤高光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，將高光譜成像技術(shù)與人工智能相結(jié)合，形成基于高光譜成像的快速、準(zhǔn)確、安全的腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的術(shù)中輔助診斷。