HE和Giemsa染色在兒童細(xì)菌性和過敏性結(jié)膜炎診斷中的比較

高 娜，侯 磊，郝雪蓮，亢澤峰

0引言

細(xì)菌性與過敏性結(jié)膜炎均為臨床常見疾病，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致患者視力下降，并以結(jié)膜充血、水腫、濾泡等為主要癥狀[1]。過敏性結(jié)膜炎主要是由于真菌或塵螨等引起的，其主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查與病理學(xué)檢查等進(jìn)行診斷及分型。

研究顯示，兒童急性細(xì)菌性結(jié)膜炎發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[2]。細(xì)菌性結(jié)膜炎主要為感染性眼科疾病，其主要是由有害病原菌侵染造成的，臨床表現(xiàn)為眼灼熱感、刺癢等，嚴(yán)重影響視功能[3]。目前臨床常將細(xì)菌性結(jié)膜炎患者誤診為過敏性結(jié)膜炎，因而需選擇適當(dāng)?shù)姆椒▍^(qū)別診斷。臨床病理學(xué)檢查方法中蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staing，HE)應(yīng)用廣泛，其檢查結(jié)果對(duì)臨床用藥及治療方案的選擇均具有重要意義，但操作過程較為復(fù)雜[4]。另有研究顯示，吉姆薩(Giemsa)染色法可用于檢查眼部微生物感染性疾病，并可明顯區(qū)分病原微生物與背景顏色，且操作簡便[5]。關(guān)于HE與Giemsa染色法診斷結(jié)膜炎的相關(guān)研究相對(duì)較少，因此本研究比較分析HE與Giemsa染色法對(duì)兒童細(xì)菌性及過敏性結(jié)膜炎的診斷價(jià)值，以期為提高臨床診斷效率提供參考。

1對(duì)象和方法

1.2方法

1.2.1采集標(biāo)本取兩張清潔載玻片并做標(biāo)記，于酒精燈火焰外焰進(jìn)行高溫消毒，晾涼備用。鹽酸奧布卡因滴眼液對(duì)患者眼瞼結(jié)膜進(jìn)行表面麻醉，用消毒后的金屬刮鏟輕輕刮取患者上下瞼結(jié)膜，刮取物以甲醛固定于消毒后的載玻片上，風(fēng)干制片。

1.2.2 HE染色將切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理并將其放入不同濃度乙醇中浸泡，采用蘇木精將標(biāo)本進(jìn)行染色，10min后用蒸餾水清洗并將其放入伊紅染液(0.1%～0.5%)中染色3min，之后在不同濃度梯度(100%、95%、85%、70%)乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，蒸餾水清洗多余染液后加入中性樹膠封固，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。染色過程中值得注意的問題：(1)使用Gill蘇木精染液防止染液污染；(2)脫蠟時(shí)將切片放入透明劑中上下提放多次加快脫蠟；(3)脫水、浸蠟時(shí)最適溫度為65℃；(4)染色過程中勿讓切片處于干涸狀態(tài)；(5)樹膠濃度適宜。

1.2.3 Giemsa染色 備好的Giemsa原液中加入蒸餾水進(jìn)

行稀釋，乙酸與乙醇(比例為1∶3)進(jìn)行固定，去離子水沖洗，將其置于鹽酸溶液(溫度為60℃)中水解8min，去離子水清洗后置于磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)中浸泡10min，之后吉姆薩染色2h(溫度為5℃)，蒸餾水清洗標(biāo)本后晾干，中性樹膠封固并將其置于光學(xué)顯微鏡下觀察。染色過程中值得注意的問題：(1)Giemsa稀釋液只可使用一次即不可重復(fù)使用；(2)由于染色時(shí)間較長需浸染而非滴染；(3)觀察Giemsa原液是否有效即表面有金色氧化膜；(4)Giemsa原液稀釋后需用濾紙過濾；(5)染色后可根據(jù)染色情況采用正丁醇進(jìn)行分化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

經(jīng)臨床診斷，422例患兒中，病毒性結(jié)膜炎216例，細(xì)菌性結(jié)膜炎97例，過敏性結(jié)膜炎109例。HE染色診斷細(xì)菌性結(jié)膜炎診斷陽性率及符合率顯著低于Giemsa染色(P<0.001)，而過敏性結(jié)膜炎診斷陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。兩種染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)見圖1、2，過敏性結(jié)膜炎HE染色中嗜酸性粒細(xì)胞邊界不清，且胞漿內(nèi)模糊不清；Giemsa染色中嗜酸性粒細(xì)胞邊界清楚且胞漿內(nèi)清晰可見。

表1 兩種染色方法診斷陽性率及符合率比較 例(%)

圖1 HE染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)(×400) A：細(xì)菌性結(jié)膜炎；B：過敏性結(jié)膜炎。

圖2 Giemsa染色方法在不同類型結(jié)膜炎中的體現(xiàn)(×400) A：細(xì)菌性結(jié)膜炎；B：過敏性結(jié)膜炎。

3討論

兒童結(jié)膜炎是由于外界或機(jī)體自身因素引發(fā)結(jié)膜組織的炎性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還可引起眼部相關(guān)并發(fā)癥，同時(shí)嚴(yán)重?fù)p害視力，因而早期診斷對(duì)提高治療效果具有重要意義[8]。過敏性結(jié)膜炎的臨床特征不具有特異性導(dǎo)致診治過程中出現(xiàn)誤診、漏診等情況，嚴(yán)重影響患者的身體健康及生活[9-10]。病原菌侵染引起的細(xì)菌性結(jié)膜炎與過敏性結(jié)膜炎的臨床特征差異不明顯，臨床診斷時(shí)常將二者混淆導(dǎo)致治療效果不佳[11]。結(jié)膜炎的誘因與細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)不盡相同，而染色涂片檢測對(duì)鑒別診斷細(xì)菌性結(jié)膜炎與過敏性結(jié)膜炎具有重要意義[12]。因此，本研究分析HE與Giemsa兩種染色方法對(duì)兒童細(xì)菌性/過敏性結(jié)膜炎的診斷結(jié)果，對(duì)臨床診斷與合理選擇治療方案均具有重要意義。

HE染色是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域細(xì)胞與組織學(xué)最廣泛的染色方法，在病理實(shí)驗(yàn)室中為常規(guī)染色方法，在染色過程中應(yīng)按照標(biāo)本的類型采取一定準(zhǔn)備措施以提高染色質(zhì)量[13]。HE染色是臨床廣泛使用的一種診斷方法，其具有較高的診斷價(jià)值，但該方法操作過程中易受到藥液揮發(fā)等因素影響造成染色效果不明顯，因而應(yīng)將送檢標(biāo)本進(jìn)行妥善固定并確保組織及活體成分處于正常狀態(tài)以免影響制片質(zhì)量[14-15]。此外，組織或活體成分及其形態(tài)等遭到破壞將直接影響檢測質(zhì)量，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并避免不利因素，HE染色結(jié)果的準(zhǔn)確度將會(huì)顯著提高[16]。本研究中用蘇木精將細(xì)胞核染成藍(lán)色，伊紅將細(xì)胞漿染成紅色或粉紅色，尤其嗜酸性粒細(xì)胞胞漿中充滿嗜酸性顆粒被染成紅色，二者形成鮮明對(duì)比，在顯微鏡低倍鏡下非常易于觀察，但對(duì)細(xì)菌染色則無特異性，說明應(yīng)用HE染色方法診斷過敏性結(jié)膜炎是非常高效、敏感的。提示病理診斷技術(shù)可有效判斷細(xì)菌性或過敏性結(jié)膜炎，其中HE染色技術(shù)占據(jù)重要地位，但仍需改進(jìn)HE染色操作技術(shù)以便提高制片質(zhì)量并進(jìn)一步提高染色準(zhǔn)確率從而提高病理診斷準(zhǔn)確率。

Giemsa染色法可用于觀察分析染色體核型，研究顯示染色體異常與機(jī)體生理病理過程密切相關(guān)[17]。研究表明Giemsa染色法可清晰觀察胃病患者幽門螺桿菌的分布情況，此方法取材直接并可直接獲得結(jié)果，有利于臨床診斷及治療[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)將病理組織切片進(jìn)行Giemsa染色有利于病理分型的劃分并可清楚顯示真菌感染部位，對(duì)提高臨床治療效果具有重要應(yīng)用價(jià)值[19-20]。Giemsa染色法過程簡單，染液容易配置，細(xì)菌被染成藍(lán)到紫紅色，細(xì)菌的形態(tài)可清晰呈現(xiàn)，細(xì)胞漿呈淡藍(lán)色，遇嗜酸性顆粒可將其染成橘紅色，但均必須于鏡下觀察，才能更加明確。本研究結(jié)果顯示HE染色診斷細(xì)菌性結(jié)膜炎陽性率及符合率顯著低于Giemsa染色，而過敏性結(jié)膜炎陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HE與Giemsa染色法均可促使結(jié)膜炎標(biāo)本中嗜酸性粒細(xì)胞顯色，但Giemsa染色效果優(yōu)于HE染色法。本研究結(jié)果揭示應(yīng)用Giemsa染色方法診斷細(xì)菌性結(jié)膜炎是非常準(zhǔn)確的，同時(shí)可以結(jié)合HE染色再次驗(yàn)證過敏性結(jié)膜炎，并可有助于臨床及時(shí)對(duì)癥用藥從而提高治愈率。

綜上所述，Giemsa染色比HE染色對(duì)細(xì)菌性結(jié)膜炎診斷效果好，且不易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，同時(shí)有助于臨床提高細(xì)菌性與過敏性結(jié)膜炎的診斷率，為提高兒童細(xì)菌性與過敏性結(jié)膜炎的治療方案提供參考依據(jù)。

1楊森, 唐建明, 忽俊, 等. 疏風(fēng)明目方超聲霧化對(duì)過敏性結(jié)膜炎患者淚膜穩(wěn)定性及淚液相關(guān)指標(biāo)的影響. 國際眼科雜志 2019; 19(6): 1068-1071

2薛艷萍. 鹽酸左氧氟沙星滴眼液治療細(xì)菌性結(jié)膜炎的臨床效果分析. 河南醫(yī)學(xué)研究 2016; 25(12): 2162-2163