NVG患者房水和血清中VEGF-A和PDGF及PEDF的臨床意義

李鈺潔，侯 旭，張 茜

0引言

新生血管性青光眼(neovascular glaucoma，NVG)是一種常見的繼發(fā)性青光眼，其虹膜表面和房角新生血管的形成導(dǎo)致小梁網(wǎng)與周邊的虹膜組織相粘連，進而導(dǎo)致進行性眼壓升高，是一種臨床治療較為棘手的嚴(yán)重致盲性眼病[1]。NVG多繼發(fā)于視網(wǎng)膜缺血、炎癥及手術(shù)外傷等疾病，其中糖尿病性視網(wǎng)膜疾病(diabetic retinopathy, DR)及視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion, CRVO)占到其病因的近70%[2]。

目前，NVG具體的發(fā)病機制尚未明確，但普遍認(rèn)為視網(wǎng)膜缺氧、炎癥導(dǎo)致多種細胞因子的過量表達是NVG形成的主要原因，其中血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)被認(rèn)為是最為關(guān)鍵的血管生成因子，抗VEGF制劑也廣泛應(yīng)用于眼部新生血管性疾病的治療[3-4]。但單獨抗VEGF治療并不能完全抑制NVG新生血管的形成，有研究發(fā)現(xiàn)血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)也參與了眼內(nèi)病理性新生血管的形成[5]。而色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是一種重要的血管生成抑制劑，可抑制多種新生血管的形成[6-7]。本研究通過定量測定NVG及年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水和血清中VEGF-A、PDGF及PEDF的含量并分析其意義，探索治療NVG的新方法。

1對象和方法

1.1對象本研究為前瞻性臨床試驗，通過空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并遵守《赫爾辛基宣言》關(guān)于人體受試者研究的規(guī)定。所有受試者均書面簽寫知情同意書。收集2015-12/2016-12在西京醫(yī)院眼科住院的NVG患者23例23眼。所有患者均為漢族，其中男13例，女10例，年齡32～76(平均56.1±15.7)歲，病程2～18(平均6.5±2.8)mo，術(shù)前眼壓35～50(平均40.5±5.7)mmHg。其中原發(fā)病為DR 13例，CRVO 9例，Eales 1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)裂隙燈及房角鏡檢查虹膜表面、房角有新生血管，非接觸眼壓計測量眼壓≥21mmHg；(2)患者因角膜水腫或玻璃體混濁無法行視網(wǎng)膜激光光凝治療；(3)常規(guī)抗青光眼藥物治療無效、患者及家屬同意接受抗VEGF聯(lián)合抗青光眼手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)3mo內(nèi)曾行抗VEGF藥物治療的患者；(2)曾行眼科手術(shù)治療的患者(包括白內(nèi)障手術(shù))；(3)既往或目前患有眼部炎癥、年齡相關(guān)性黃斑變性等與VEGF相關(guān)疾病的患者；(4)全身合并其他疾病的患者：包括高血壓、腦栓塞、充血性心衰、腎功能異常、全身腫瘤；(5)孕期及哺乳期患者。年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者組的納入標(biāo)準(zhǔn)：選擇同時期在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科住院的年齡相關(guān)性白內(nèi)障漢族患者23例23眼作為對照組，其中男12例，女11例，年齡57～73(平均62.4±3.5)歲，病程3～36(平均12.5±9.8)mo，術(shù)前眼壓12～18(平均13.8±2.4)mmHg。排除眼部其他疾病、全身性疾病、孕期及哺乳期患者。NVG組和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者組的性別、年齡基本一致(χ2=0.09，P>0.05；t=-13.57，P>0.05)，具有可比性，而年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者組的病程高于NVG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.42，P<0.01)。

1.2方法NVG患者行玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗注射液0.5mg，年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者行白內(nèi)障超聲乳化聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)。房水標(biāo)本于手術(shù)操作前25G針頭行前房穿刺抽取房水100L、放置于無菌離心管并于-80℃冷凍保存。血清標(biāo)本于患者手術(shù)前抽取空腹靜脈血5mL,1000r/min轉(zhuǎn)離心15min提取血清，并于-80℃冷凍保存。酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)分析：人VEGF-A、PDGF、PEDF的ELISA試劑盒均由上海朗頓科技生物有限公司提供，ELISA檢測均嚴(yán)格按照說明書操作。

2結(jié)果

2.1兩組患者房水和血清中VEGF-A和PDGF及PEDF的含量分析NVG患者房水中VEGF-A、PDGF的含量顯著高于年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者組，PEDF的含量顯著低于年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。NVG、年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者血清中VEGF-A、PDGF及PEDF的含量均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者房水及血清中VEGF-A、PDGF及PEDF含量的比較

2.2 NVG患者房水和血清中VEGF-A、PDGF及PEDF含量之間的相關(guān)性分析NVG患者房水中VEGF-A與PDGF含量呈正相關(guān)(r=0.502，P=0.015)，VEGF-A與PEDF含量呈負相關(guān)(r=-0.480，P=0.020)，見圖1、2。而NVG患者房水中PDGF與PEDF含量無明顯相關(guān)性(P>0.05)；NVG患者房水中VEGF-A、PDGF及PEDF的含量與血清中的含量均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 NVG患者房水中PDGF與VEGF-A濃度的相關(guān)性分析。

圖2 NVG患者房水中PEDF與VEGF-A濃度的相關(guān)性分析。

3討論

VEGF是一種多功能的細胞因子，在血管生成及淋巴管的生成中有著直接和間接的調(diào)控作用，VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、胎盤生長因子(placental growth factor, PIGF)、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F，其中VEGF-A、PIGF主要參與血管的生成，VEGF-A被公認(rèn)為是最關(guān)鍵的血管生成因子，且VEGF-A具有多種亞型，其中VEGF-A165是最主要的亞型。研究已證實VEGF通過與VEGFR結(jié)合激活多種信號級聯(lián)進而聚集血管前體細胞和單核細胞，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，同時還可以增加血管通透性、擴張血管[8-9]。本研究中NVG患者房水中VEGF-A的含量顯著高于對照組，與Chen等[10]及Zhou等[11]的研究相一致，再次證實了VEGF-A在NVG發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)NVG患者玻璃體內(nèi)注射抗VEGF制劑，注射后1d即可出現(xiàn)虹膜熒光素血管造影滲漏減少、并可持續(xù)1mo余[12]。也有研究證實抗VEGF制劑通過顯著降低NVG患者房水中VEGF的含量進而減少虹膜和房角的新生血管生成[11]。目前，已知的抗VEGF制劑包括哌加他尼鈉—特異性結(jié)合VEGF-A165，貝伐單抗、雷珠單抗—結(jié)合所有的VEGF-A，阿柏西普、康柏西普—結(jié)合VEGF-A、VEGF-B和PIGF?？筕EGF制劑已應(yīng)用于NVG患者的臨床治療中，然而，單獨抗VEGF治療并不能完全消除虹膜新生血管，推測其他細胞因子也可能參與了眼內(nèi)病理性新生血管的生成。

PDGF家族包括PDGF-A、B、C、D四種亞基，分別組合成PDGF-A、PDGF-B、PDGF-AB、PDGF-C及PDGF-D五種類型，其中PDGF-C及PDGF-D是近年來發(fā)現(xiàn)的新成員。PDGF通過與PDFGFα受體或β受體結(jié)合進而促進多種細胞的增殖、遷移和分化，是一種促進細胞增殖、血管修復(fù)新生的生長因子，在血管的生成中起著十分重要的作用[13-14]。大量研究已經(jīng)證實，PDGF與VEGF具有顯著的同源性，亦在眼內(nèi)病理性新生血管的形成中發(fā)揮著舉足輕重的作用[15]。Simpso等[16]在視網(wǎng)膜缺氧的動物模型中發(fā)現(xiàn)，PDGF-A、PDGF-B及VEGF的表達水平顯著升高。Jo等[17]也研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制PDGF-B及VEGF-A的信號通路比單純抑制VEGF-A更能顯著促進眼內(nèi)病理性新生血管的回歸。我們前期從分子機制學(xué)方面研究提示，PDGF-C也參與了眼內(nèi)病理性新生血管的生成，并通過動物模型進一步證實，阻斷PDGF-C的表達可以顯著減少眼內(nèi)病理性新生血管的生成[5]。同時也發(fā)現(xiàn)NVG患者房水中PDGF-C的含量顯著高于白內(nèi)障對照組[18]。本研究中NVG患者房水中PDGF的含量顯著高于對照組，且PDGF的含量與VEGF呈正相關(guān)，再次證實了PDGF與NVG新生血管的形成密切相關(guān)，若能抑制PDGF/PDGFR的作用，可能為眼內(nèi)新生血管性疾病的治療提供一種新的途徑，未來若能聯(lián)合抑制VEGF治療，可能效果更佳。

在健康人正常眼內(nèi)，促血管生成因子與抑制血管生成因子處于平衡狀態(tài)，當(dāng)組織出現(xiàn)缺氧、炎癥、外傷等情況時，這種平衡將被破壞，進而出現(xiàn)眼部病理性新生血管。PEDF是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成抑制劑，其不僅能抑制細胞外基質(zhì)VEGF等促血管因子的表達、還能激活細胞內(nèi)的凋亡通路進而促進內(nèi)皮細胞的凋亡，從而抑制新生血管的生成[6-7]。更重要的是，PEDF抑制新生血管具有選擇性，只抑制新生血管的形成，而對已成熟的血管無抑制作用。這一優(yōu)勢大大降低了臨床應(yīng)用的毒副作用，具有很大的應(yīng)用前景[19]。本研究中NVG患者房水中PEDF的含量顯著低于年齡相關(guān)性白內(nèi)障組，且PEDF與VEGF含量呈負相關(guān)，這一結(jié)果與Sun等[20]的研究相一致。我們還發(fā)現(xiàn)NVG患者血清中VEGF-A、PDGF及PEDF的含量與對照組均無明顯變化，且NVG患者房水中VEGF-A、PDGF及PEDF的含量與血清中的含量均無明顯相關(guān)性。有報道，VEGF-A與糖尿病微血管病變密切相關(guān)，糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中VEGF-A的含量顯著高于對照組，這一結(jié)果與本研究數(shù)據(jù)不一致，可能由于NVG患者的原發(fā)疾病除了DR外還包括了CRVO等疾病，且本研究樣本量有限，還有待于后續(xù)進一步研究探討。

眾所周知，年齡相關(guān)性白內(nèi)障為老年性生理性疾病，為眼科需要手術(shù)的疾病中最接近健康人的一種疾病，且目前尚未發(fā)現(xiàn)其與VEGF、PDGF及PEDF的相關(guān)性報道，故本研究中我們選取年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者作為對照組。本文通過定量分析NVG患者房水中促血管生成因子與抑制血管生成因子的濃度水平，并與國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)報道相對比，進而探索治療NVG的新方法；尤其是PDGF的水平濃度，我們課題組前期從動物試驗分子機制方面證實PDGF參與了眼內(nèi)病理性新生血管的生成，本實驗客觀證實了NVG患者房水中PDGF的水平亦升高，為后期NVG抗新生血管的聯(lián)合靶向制劑研究提供了新思路。

綜上所述我們推測，房水中VEGF-A、PDGF與PEDF的比例失調(diào)在NVG新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用，聯(lián)合使用VEGF-A、PDGF抑制劑及PEDF可能為NVG治療提供新的方法，其使用效果還有待于進一步探索。