正常幼兒及不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中常見(jiàn)miRNA的表達(dá)

張 建，景瑞花，秦 莉，裴 澄，吳昌睿

0引言

白內(nèi)障是世界首位致盲眼病，不同年齡段均可發(fā)病[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是包含21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[2]。已有研究表明，miRNA在不同年齡段白內(nèi)障的發(fā)生中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚不完全明確。既往研究證實(shí)，晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)miR-184，miR-204，miR-183，miR-181b，miR-182，miR-125b，miR-124，let-7a/b/d這10條miRNA顯著高表達(dá)[3-7]，提示其可能在晶狀體相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)晶狀體中這10條常見(jiàn)miRNA的表達(dá)水平，比較其在正常幼兒及不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)差異，并進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、GO和 KEGG富集分析，為深入研究miRNA在不同年齡段白內(nèi)障發(fā)生中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象正常幼兒晶狀體組織取自死亡8～24h的尸體眼，來(lái)源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院角膜移植供體患兒，透明晶狀體6個(gè)，年齡1～4(平均2.2±0.6)歲；不同年齡段白內(nèi)障晶狀體組織來(lái)源于幼兒(先天性白內(nèi)障)、中青年、老年(年齡相關(guān)性白內(nèi)障)患者手術(shù)過(guò)程中撕除的前囊膜，其中幼兒白內(nèi)障患者標(biāo)本6例，年齡1～3(平均2.0±0.4)歲；中青年白內(nèi)障患者標(biāo)本6例，年齡29～45(平均38.7±4.5)歲；老年白內(nèi)障患者標(biāo)本6例，年齡62～68(平均65.3±6.8)歲。正常幼兒和白內(nèi)障幼兒年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.535，P=0.605)，幼兒、中青年和老年白內(nèi)障患者各組間年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-16.892、-61.324、-21.432，均P<0.05)。所有病例均排除其他眼部病變，晶狀體組織均取自晶狀體前囊膜，每組標(biāo)本隨機(jī)平均分為3等份，用來(lái)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。本研究嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》，并征得患者及/或其監(jiān)護(hù)人的知情同意，獲得西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.1 stem-loop RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成miRNA檢測(cè)需要三種引物，即stem-loop RT引物、miRNA特異性正向引物和一致的miRNA反向引物。stem-loop RT引物是一段含44個(gè)堿基的特定序列之后延續(xù)6個(gè)特異性堿基，這6個(gè)特異性堿基與miRNA 3’端的6個(gè)堿基反向互補(bǔ)。miRNA特異性正向引物是一段特定的富含GC的序列之后延續(xù)特異性堿基，該特異性堿基是由除外miRNA 3’端8個(gè)堿基后剩余堿基組成(表1)。一致的miRNA反向引物是一段特定的堿基序列(GTGCAGGGTCCGAGGT)。miRNA引物由西安壯志生物科技有限公司合成。

表1 miRNA序列及其stem-loop RT引物和特異性正向引物

1.2.2晶狀體組織總RNA的提取(1)晶狀體組織冰上勻漿后移入1.5mL EP管中，加Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)1mL，混勻，室溫靜置5min。(2)加氯仿0.2mL，震蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12 000g離心15min。(3)吸取上層水相0.4mL，移至另一EP管中，加0.4mL異丙醇，室溫10min，4℃、12 000g離心10min。(4)倒掉上清液，加75%乙醇(無(wú)RNA酶水配置)1mL，震蕩充分洗滌沉淀，4℃、7500g離心5min。(5)干燥后沉淀溶解于無(wú)RNA酶水中備用。

1.2.3 stem-loop RT-PCR法檢測(cè)miRNA的表達(dá)每個(gè)樣本取總RNA 1μL，2μmol/L stem-loop RT引物1μL，加入到RT體系中，震蕩溶解后短暫離心，設(shè)置反應(yīng)條件為42℃ cDNA合成60min，85℃反轉(zhuǎn)錄失活5s，-20℃保存?zhèn)溆谩T反應(yīng)后的cDNA溶液稀釋為濃度0.5ng/μL，將miRNA正向引物和反向引物配制為濃度0.2μmol/L，取該兩種溶液各5μL，并且與10μL SYBR green混合，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3min 1個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 30s 40個(gè)循環(huán)，從65℃開(kāi)始，每5s增加0.5℃到95℃，最后4℃結(jié)束。內(nèi)參采用β-actin，引物序列：F：ACTACCTCATGAAGATCCTCA，R：CAGGAGGAGCAATGATCTTGA。逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR結(jié)果分析采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及GO/KEGG富集分析本研究使用miRWalk2(http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)在線工具預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，然后匯總并采用R語(yǔ)言clusterprofiler包(http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

2結(jié)果

2.1常見(jiàn)的晶狀體miRNA近年來(lái)不同研究者采用多種分子生物學(xué)技術(shù)(如Insituhybridization、Microarray等)檢測(cè)逾50種miRNA在晶狀體組織中的表達(dá)，不同方法檢測(cè)晶狀體組織中miRNA表達(dá)譜不盡相同，但部分miRNA表達(dá)豐度高且功能已經(jīng)有了初步研究，文獻(xiàn)中已有不同研究方法檢測(cè)到了晶狀體中miRNA的表達(dá)，見(jiàn)表2。

表2 不同方法檢測(cè)晶狀體中miRNA的表達(dá)

2.2正常幼兒晶狀體中miRNA的表達(dá)使用stem-loop RT-PCR法檢測(cè)上述10種miRNA在正常幼兒晶狀體中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)所有的miRNA均可被檢測(cè)，但是表達(dá)量各不相同(F=27，P=0.000068)，其中miR-184的Ct值(miRNA Ct值與其起始含量相關(guān)，起始含量越高，Ct值越小)明顯低于其他miRNA，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000092、0.000065、0.00043、0.00023、0.00012、0.00034、0.00056、0.00054、0.00012)，表明miR-184在正常幼兒晶狀體中含量最高(圖1)。

圖1 正常幼兒晶狀體組織中miRNA的表達(dá) bP<0.01 vs miR-184。

2.3正常幼兒與先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中miRNA的表達(dá)使用stem-loop RT-PCR法檢測(cè)正常幼兒與先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常幼兒相比，先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中6種miRNA表達(dá)升高(miR-184、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-125b、let-7d)，其余均降低，其中miR-184、miR-182表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12，P=0.0002；t=5.27，P=0.0061)，且miR-182表達(dá)升高最明顯；miR-124、miR-204表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.6，P=0.0009；t=13，P=0.00015)，且miR-204降低最明顯(圖2)。

圖2 正常幼兒與先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中miRNA的相對(duì)表達(dá)差異 bP<0.01 vs 正常幼兒。

2.4不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中miRNA的表達(dá)使用stem-loop RT-PCR法檢測(cè)不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與幼兒患者相比，中青年和老年患者晶狀體中miRNA表達(dá)均有變化(miR-184：F=91.3，P=0.00070；let-7a：F=82.19，P=0.00008；miR-204：F=32.09，P=0.00055；miR-181b：F=24.05，P=0.001；miR-182：F=31.99，P=0.0006；miR-183：F=120.9，P=0.0007；miR-125b：F=8.533，P=0.0176；miR-124：F=19.00，P=0.0025；let-7b：F=10.33，P=0.0114；let-7d：F=130.9，P=0.0001)，中青年患者晶狀體中miR-204(P=0.034)、miR-124(P=0.033)、let-7d(P=0.00013)表達(dá)升高，miR-184(P=0.00009)、miR-183(P=0.0045)、let-7a(P=0.00005)表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；老年患者晶狀體中miR-204(P=0.000085)、miR-182(P=0.0076)，miR-124(P=0.003)表達(dá)升高，miR-184(P=0.00006)、miR-181b(P=0.00096)、miR-183(P=0.00015)、miR-125b(P=0.003)、let-7a(P=0.00003)、let-7b(P=0.0176，P=0.005)、let-7d(P=0.023)表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中miRNA的相對(duì)表達(dá)差異 aP<0.05，bP<0.01 vs 幼兒。

2.5差異表達(dá)的miRNA靶基因通路富集分析由于年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體中10條miRNA均存在表達(dá)差異，為了探索其可能的功能機(jī)制，本研究使用miRWalk在線工具預(yù)測(cè)這10條miRNA的靶基因，共計(jì)2937個(gè)，并進(jìn)行靶基因的GO和KEGG富集分析。靶基因的GO分析顯示(圖4A)，細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接富集最多，提示晶狀體上皮細(xì)胞與囊袋及內(nèi)層皮質(zhì)之間的緊密連接在維持晶狀體正常形態(tài)及透明性方面發(fā)揮重要作用。KEGG富集分析顯示(圖4B)，腫瘤相關(guān)通路富集最多，可能是由于腫瘤中miRNA研究最廣泛所致，眾所周知，晶狀體無(wú)腫瘤性疾病。其次細(xì)胞周期排名靠前，而晶狀體上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡是白內(nèi)障的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[8]，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miRNA在調(diào)控白內(nèi)障中發(fā)揮著重要作用。

圖4 miRNA靶基因GO和KEGG富集分析 A：10條miRNA靶基因GO富集分析；B：10條miRNA靶基因KEGG富集分析。

3討論

miRNA可調(diào)節(jié)人類基因組中約1/3基因的表達(dá)，功能涉及生物體多種生理和病理過(guò)程[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA在晶狀體中穩(wěn)定表達(dá)，它們的功能與白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)。本課題組之前的研究使用Microarry技術(shù)在成人正常晶狀體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)206種miRNA表達(dá)，其中miR-184表達(dá)最豐富，其后依次為let-7b、miR-923、miR-1826、miR-125b、miR-1308、miR-26a和miR-638，而在不同年齡段的白內(nèi)障患者晶狀體中miRNA表達(dá)譜差異明顯[10]。不同研究報(bào)道晶狀體中miRNA表達(dá)譜不盡相同，但部分晶狀體相關(guān)的miRNA(表2)始終穩(wěn)定表達(dá)。目前常見(jiàn)晶狀體相關(guān)miRNA的研究多集中在老年人(正常或白內(nèi)障)晶狀體組織中，對(duì)其在幼兒及中青年晶狀體組織中表達(dá)的研究較少。本研究提取正常幼兒晶狀體組織總RNA，檢測(cè)其中常見(jiàn)晶狀體相關(guān)miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類miRNA在正常幼兒晶狀體組織中均有表達(dá)，表達(dá)量各不相同，其中miR-184的Ct值明顯低于其他miRNA，表明miR-184在正常幼兒晶狀體組織中表達(dá)量最高，這與本課題組之前在成人透明晶狀體中的研究結(jié)果一致。miR-184在角膜上皮細(xì)胞中被首次報(bào)道，是角膜和晶狀體組織中顯著表達(dá)的一種miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，miR-184可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，通過(guò)維持SHIP2(SH2結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型肌醇5’磷酸酶)的水平抑制血管生長(zhǎng)，在維持正常角膜無(wú)血管狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。晶狀體也是眼部重要的屈光介質(zhì)之一，無(wú)血管狀態(tài)保證了其基本的屈光功能，miR-184在晶狀體中的高表達(dá)可能與其能夠維持無(wú)血管狀態(tài)相關(guān)[11-12]。

此外，有研究報(bào)道多種miRNA表達(dá)與白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)。Yao等[13]在不同生長(zhǎng)階段鼠的晶狀體中檢測(cè)miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-29c可通過(guò)調(diào)節(jié)FOS影響白內(nèi)障的發(fā)生；在研究晶狀體生長(zhǎng)、衰老過(guò)程中，Chien等研究發(fā)現(xiàn)與組織衰老相關(guān)的miR-34a表達(dá)量與晶狀體混濁程度呈正相關(guān)，嚴(yán)重混濁的晶狀體中其表達(dá)水平較高，甚至有學(xué)者認(rèn)為miR-34a可以作為白內(nèi)障的一種標(biāo)記物[14-15]。雖然有關(guān)miRNA調(diào)節(jié)白內(nèi)障發(fā)生的研究越來(lái)越多，但在先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中是否有miRNA表達(dá)的改變?nèi)院庇袌?bào)道。因此，本研究檢測(cè)先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中miRNA的表達(dá)并與正常幼兒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中多種miRNA表達(dá)發(fā)生變化，其中miR-184、miR-182表達(dá)升高，miR-124、miR-204表達(dá)降低。既往研究報(bào)道，在晶狀體中miR-124與HuB/C/D、nPTB、REST4相互作用，能夠維持晶狀體細(xì)胞的正常特性，保持晶狀體透明[16]，同時(shí)Conte等[17]研究表明在胚胎發(fā)育早期敲除miR-204基因的動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)晶狀體異常、小眼球等體征。本研究中，先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體miR-124和miR-204表達(dá)明顯降低，這與之前的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)了miR-124和miR-204對(duì)維持晶狀體正常功能及特性的重要性。

為了進(jìn)一步揭示miRNA在不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)情況，我們分別對(duì)幼兒(先天性白內(nèi)障)、中青年、老年(年齡相關(guān)性白內(nèi)障)患者晶狀體中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與先天性白內(nèi)障幼兒相比，中青年白內(nèi)障患者晶狀體miR-204、miR-124和let-7d表達(dá)升高，miR-184、miR-183和let-7a表達(dá)降低；年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體所有被檢測(cè)miRNA表達(dá)均有變化，其中miR-182、miR-204、miR-124表達(dá)升高，miR-184、miR-181b、miR-183、miR-125b、let-7a/b/d表達(dá)均降低。在表達(dá)差異miRNA中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-182在感覺(jué)器官中特異性表達(dá)，大鼠眼部組織中檢測(cè)其表達(dá)豐富，且具有重要作用[18-19]，Li等[20]發(fā)現(xiàn)miR-182與衰老相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)RARG的表達(dá)引起細(xì)胞過(guò)早發(fā)生衰竭和死亡。衰老是年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生的根本原因，本研究發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體中miR-182表達(dá)明顯高于先天性和中青年白內(nèi)障患者，這進(jìn)一步說(shuō)明了miR-182與衰老相關(guān)，并可能在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，目前關(guān)于miRNA在晶狀體中表達(dá)的研究逐年增加，但尚未見(jiàn)正常幼兒和不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中miRNA表達(dá)比較的報(bào)道。本研究在正常幼兒和不同年齡段白內(nèi)障患者晶狀體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)，其中miR-184在正常幼兒晶狀體中表達(dá)量最高；miR-124和miR-204在先天性白內(nèi)障幼兒晶狀體中的表達(dá)明顯低于正常幼兒，分析可能與它們維持晶狀體正常功能和特性相關(guān)；年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體中miR-182表達(dá)量明顯增加，分析可能與miR-182調(diào)節(jié)衰老相關(guān)。上述結(jié)果表明，miRNA在不同年齡段白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮不同作用，但其具體的作用機(jī)制尚待深入的研究。

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