MicroRNA調控肝細胞癌EMT 和細胞外基質重塑的研究進展

周 昊，封 冰綜述，王 銳審校

0 引 言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，并已成為腫瘤相關死亡的第三大原因[1]。早期肝細胞癌可以通過手術治愈。但是，由于早期癥狀不典型和缺乏合適的診斷工具，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于Ⅲ期，伴有遠處轉移，不再適合手術，只能通過靶向治療或者介入治療延長生存時間。若能夠早期發(fā)現(xiàn)轉移灶，并通過分子靶點有效抑制HCC的轉移，對于提高患者生存率及改善預后具有重要意義。本文主要就MicroRNAs(miRNAs)通過Wnt(Wingless/Int1)及轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)通路影響肝癌細胞上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及細胞外基質重塑的研究進展作一綜述。

1 HCC轉移機制

HCC轉移涉及五個經(jīng)典步驟，包括鄰近組織的局部侵入，血管內滲透，循環(huán)系統(tǒng)中的存活，外滲，以及肝(肝內)或遠端器官(肝外)的異常定植。很多時候，腫瘤遷移和侵襲與EMT緊密相關。EMT 的特點是細胞表面上皮表型減少和間質表型增多，細胞骨架重構、間葉細胞的表型增加、細胞-細胞間或細胞-基質間的黏附性減弱、細胞的移動能力增強等改變，腫瘤細胞從極性上皮樣細胞轉變?yōu)殚g充質表型細胞[2]。通過EMT，腫瘤細胞的細胞間黏附降低、運動能力增加，獲得從原位向周圍侵襲的能力，最終進入血液和淋巴途徑轉移到遠處形成新的病灶。這一過程與多種生長因子(EGF、FGF、TGF-β等)和轉錄因子有關，包括 Snail(Snail/Slug)家族，ZEB(ZEB1/ZEB2)家族和HLH家族(Twist1)等[3-5]。這些轉錄因子作用于E-cadherin啟動子，抑制其轉錄。 E-cadherin的表達缺失，能進一步激活間質細胞相關基因，如波形蛋白和N型鈣黏蛋白的轉錄及表達，從而引起細胞形態(tài)的改變，促進了腫瘤細胞的運動能力和侵襲能力[6]。此外，腫瘤細胞周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，也是腫瘤發(fā)生轉移的重要原因之一。

2 MiRNA與HCC轉移

miRNAs是一組高度保守的小型非編碼RNA，由20～22個核苷酸組成，負責基因的轉錄后調控。成熟的miRNA進入 RNA 誘導的沉默復合體中，單鏈 miRNA在輸入蛋白 XPO8的介導下與靶mRNA分子結合，隨后mRNA在復合體中的核酸內切酶argonaute的作用下被分解。在動物細胞內，miRNA與靶mRNA的結合位點不完全互補，miRNA通過靶向結合mRNAs的3′UTR，少部分則靶向mRNA的5′UTR，導致mRNA翻譯抑制，從而調節(jié)轉錄后基因表達[7]。因此，miRNA通過靶向多種基因參與調節(jié)各種生物活性。越來越多的研究表明，miRNA的失調與各種癌癥的發(fā)展和進展相關，并作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。失調的miRNA被認為是癌癥臨床診斷和預后的有用生物標志物，也是癌癥治療的潛在治療靶點[8]。然而，miRNA調節(jié)網(wǎng)絡在HCC發(fā)生、發(fā)展中的機制細節(jié)仍然很大程度上未知。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過調節(jié)多種信號通路參與了腫瘤細胞的轉移過程，如Wnt、TGF-β信號通路等，同時微環(huán)境在HCC轉移中也起到重要作用。

2.1 Wnt /β-catenin信號通路與HCC轉移在正常成熟細胞中，Wnt通路處于關閉狀態(tài)。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是細胞表面鈣黏蛋白復合物的一種成分，胞漿中的β-catenin大部分與突出于細胞膜的E-cadherin結合，形成β-catenin/E-cadherin復合體，再與肌動蛋白骨架相連，介導細胞間黏附，調節(jié)腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[9]。目前發(fā)現(xiàn)Wnt信號途徑激活有三條途徑：Wnt/Ca2+途徑、平面細胞極性途徑和正規(guī)Wnt途徑。當Wnt基因在腫瘤中被異常激活，其蛋白與胞膜卷曲蛋白(frizzled, Fz)受體結合，激活松散蛋白(dishevelled, Dsh)，進而抑制GSK3β/APC/Axin復合物對β-catenin的磷酸化，降低了β-catenin的磷酸化降解，胞質中聚集增多的β-catenin轉進入細胞核，與核內轉錄因子T淋巴細胞因子(T-cell-specific transcription factor, TCF)/淋巴樣增強因子發(fā)生作用，激活下游眾多靶基因如c-MYC和cyclin D1的過度表達, 從而誘導HCC的EMT過程[10-11]。

許多miRNA可直接與Wnt信號通路中的細胞因子相互作用。如miR-766-3p可與Wnt3a的mRNA結合，下調Wnt3a的表達，從而通過Wnt/PRC1正向調節(jié)環(huán)抑制HCC細胞的侵襲和遷移[12]。在HCC中，高表達的Wnt3a往往與預后不良相關。miR-504、miR-542-3p、miR-485-5p可與Frizzled 7(FZD7)的mRNA的3′-UTR區(qū)域結合，負向調控其表達，從而抑制HCC細胞中β-catenin的核轉位，阻止細胞核中β-catenin的積累和Wnt信號的激活[13-16]。Frizzled 5(FZD5)也是Wnt的共同受體，miR-1324直接靶向FZD5 mRNA，抑制HCC中Wnt/β-catenin信號通路的激活[17]。GSK3β是Wnt /β-catenin信號通路的重要成員，可以通過在Ser33，Ser37和Thr41處磷酸化使β-catenin降解。生物信息學分析預測GSK3β上存在miR-1246、miR-26a-5p的潛在結合位點。體外實驗證實這兩個miRNA可以直接與GSK3β mRNA結合，抑制其轉錄后翻譯，從而促進β-catentin通路的激活。臨床數(shù)據(jù)也驗證了在肝癌組織中miR-1246、miR-26a-5p表達明顯上升，與腫瘤臨床分期及預后呈負相關[18-19]。

除直接影響通路中的細胞因子外，miRNA還可作用于一些與Wnt/β-catenin信號通路存在相互作用的細胞因子。分泌的分泌性卷曲相關蛋白(secreted frizzled- related protein, SFRP)是一種可溶性的分泌性糖蛋白, 位于染色體8p12-11.1，可與卷曲受體競爭Wnt蛋白[20]。miR-27a與SFRP1的mRNA 結合，在轉錄后水平抑制其表達。SFRP1的表達降低會導致更多的Wnt蛋白與Fz受體結合，進而促進EMT發(fā)生[21]。FOXO3a是Forkhead box O(FOXO)轉錄因子家族的成員，可與β-catenin結合，是一種腫瘤抑制基因。FOXO3a與TCF競爭β-catenin，減少β-catenin/TCF復合物的形成，抑制Wnt /β-catenin通路的下游信號傳導。miR-182-5p與FOXO3a mRNA的72-79位點存在互補序列，在轉錄后水平抑制FOXO3a表達，進而增強β-catenin與TCF4之間的相互作用，促進Wnt/β-catenin通路的激活。此外，β-catenin的表達增多會反過來促進miR-96，miR-182和miR-183的轉錄，形成Wnt /β-catenin-miRNA正反饋環(huán)，進一步誘導肝細胞癌發(fā)生和進展[22]。

有的miRNA會同時對兩種及以上的細胞因子產(chǎn)生影響。miR-500a可直接結合SFRP2和GSK-3βmRNA的3′-UTR，同時增強Wnt蛋白與卷曲受體的結合并減少β-catenin的降解，增加Wnt通路下游靶點的激活[23]。有的miRNA還可同時影響多個信號通路。HMGA2是一種高遷移率A族蛋白質的膜，是一種非組蛋白染色質結合蛋白，參與調節(jié)各種類型癌癥發(fā)生和進展。與正常組織相比，HMGA2在各種類型的腫瘤組織中都表達增加，在肝細胞癌中也是如此。miR-337可通過結合HMGA2來抑制PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路的激活，發(fā)揮抑癌基因的作用[24]。

2.2 TGF-β通路TGF-β是轉化生長因子的一個重要亞類，其家族龐大，包括9個亞族，共27類因子，參與調節(jié)胚胎發(fā)育過程中的EMT現(xiàn)象。其機制主要是通過Smad依賴通路和非Smad依賴通路完成的。Smad蛋白存在于胞質中，是由Smad基因編碼的相對分子質量為42 000～60 000 Da 的蛋白質分子。作為TGF-β受體復合物的下游信號調節(jié)蛋白, Smads蛋白家族可將信號由胞膜傳導至胞核, 從而調控基因轉錄。典型的Smad依賴通路誘導的EMT過程如下: TGF-β首先與腫瘤細胞膜上的TGF-βⅡ 型受體(TpRⅡ)結合, 通過TpRⅡ激酶使TGF-βⅠ型受體(TpRⅠ)磷酸化后激活下游的Smad2/3, 磷酸化的Smad2/3再與胞內的Smad4結合形成三聚體, 進入細胞核, 并與DNA結合而發(fā)生相互作用, 促使EMT形成。而非Smad依賴通路中，活性TGF-β受體則激活PI3K/AKT，ERK，JNK/p38和RhoA等信號通路，誘導其下游轉錄。異常的TGF-β表達是腫瘤發(fā)展的罪魁禍首之一。最初，是抑制細胞生長并誘導細胞凋亡的腫瘤抑制因子。然而，在腫瘤進展的后期階段，TGF-β充當腫瘤啟動子，與腫瘤侵襲性的增強和遠處轉移相關[25]。

根據(jù)miRNA靶基因的多樣性，靶標預測表明TGF-β信號傳導途徑中的許多個組分都被miRNA靶向。通過實驗，已經(jīng)證實多種miRNA通過靶向配體、受體、Smad蛋白和非Smad依賴通路中的組分調節(jié)TGF-β信號通路的激活。miR-142、miR-542-3p可通過直接靶向TGF-β1的3′UTR，抑制TGF-β1的翻譯，從而抑制TGF-β信號通路的激活。在HCC中，miR-542-3p的表達減少、而miR-142發(fā)生甲基化，進一步誘發(fā)腫瘤的進展[26]。許多miRNA與TGF-β受體結合，特別是TGF-βⅡ型受體(TpRⅡ)，如miR-302d、miR-590-5p等。這些miRNA與TpRⅡ受體mRNA結合，抑制其翻譯，從而抑制TGF-β通路下游因子的激活，從而抑制HCC細胞的EMT過程[27-28]。

2.3 Smad依賴通路SMAD蛋白是Smad依賴通路中的關鍵節(jié)點，許多miRNA均靶向SMAD蛋白，miR-142就是其中之一?？膳cSMAD3的mRNA結合，從而抑制TGF-β的激活。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在HCC的發(fā)展過程中，miR-142在HCC細胞中過度甲基化，導致其表達顯著減少，促進腫瘤的轉移[29]。而miR-125b則可抑制SMAD2及SMAD4的翻譯，從而削弱EMT和相關性狀[30]。

Fos相關抗原2(FOSL2/FRA2)與FOS異二聚體和Jun同源二聚體一起構成AP-1轉錄因子家族。FOSL2促進侵襲性腫瘤生長，在TGF-β信號通路的調節(jié)中起重要作用，在HCC中Fos水平明顯升高。miR-133a通過靶向FOSL2影響Smad3蛋白的表達，從而抑制HCC的轉移[31]。

miR-145通過HCC中Smad3的特定結構域特異性磷酸化，產(chǎn)生pSmad3C從而抑制腫瘤進展。而miR-21通過ERK1/2/MAPK促進腫瘤的增殖和轉移。反之，pSmad3C的增加又導致miR-145表達上調及miR-21下調，從而進一步抑制腫瘤進展[32]。

2.4 非Smad依賴通路TGF-β信號通路的下游轉錄因子同時調節(jié)許多miRNA的轉錄，如miR-200家族、miR-203和miR-216/217等。TGF-β信號通路下游的轉錄因子ZEB家族等均可抑制其轉錄。TGF-β信號通路和miRNA途徑相互影響，形成反饋調節(jié)環(huán)。ZEB家族包括ZEB1，ZEB2，Snail1和Slug，在調節(jié)生理和病理性EMT中發(fā)揮核心作用。在EMT過程中，ZEB1不僅可與E-鈣黏蛋白啟動子的E-box元件結合來抑制E-鈣黏蛋白轉錄，還可激活間充質基因。

MiR-200家族是最經(jīng)典的調控EMT的miRNA家族。其包含五個miRNA：miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-200a、miR-141。分別由miR-200b/200a/429和miR-200c/141兩個簇轉錄，這兩個簇的啟動子區(qū)域存在ZEB型E-box元件，當發(fā)生EMT時被TGF-β誘導的轉錄抑制因子ZEB1和ZEB2抑制。相反，miR-200家族靶向ZEB1/2的3′-UTR。因此，ZEB1/2和miR-200家族形成雙向負反饋環(huán)。此外，miR-200家族還通過調節(jié)Rho-ROCK信號傳導、黏著斑、基質金屬蛋白酶等EMT的關鍵轉錄因子來維持上皮特性并防止轉移。另外，miR-205、miR-101也存在類似的機制[33]。

在HCC中，miR-630作為腫瘤抑制因子靶向Slug抑制HCC的轉移。在miR-630轉錄起始位點上游的1.0-kb區(qū)域存在SP1和c-Jun的響應元件。TGF-β通過Erk/SP1和JNK/c-Jun信號通路抑制miR-630轉錄，從而間接上調Slug，促進HCC細胞運動和侵襲。除調節(jié)信號傳導，部分miRNA可直接影響鈣黏蛋白的翻譯。miR-199b-5p、miR-194可直接靶向N-鈣粘蛋白的3′-UTR端，從而顯著抑制HCC細胞中N-鈣黏蛋白的表達，抑制HCC細胞的轉移。此外miR-199b-5p還可抑制TGF-β1激活的Akt磷酸化，TGF-β1通過Akt磷酸化誘導N-鈣黏蛋白過度表達。同時TGF-β1還通過非Smad信號傳導途徑miR-199b-5p下調，形成了一個調節(jié)環(huán)[34-35]。

miR-34/miR-449家族由6個同源成員組成：miR-34a，miR-34b，miR-34c，miR-449a，miR-449b和miR-449c。miR-449a，miR-449b和miR-449c均由CDC20B的第二個內含子中基因簇編碼，由組蛋白乙?；餐{節(jié)，以細胞系依賴性方式調節(jié)SOX4。轉錄因子SOX4的生理功能是調節(jié)胚胎發(fā)育過程中的發(fā)育過程，如調節(jié)纖毛發(fā)生和膽管形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HCC標本中SOX4是表達明顯上升。而SOX4轉錄因子受TGF-β下游的Smad2和Smad3直接調控，SOX4過表達是TGF-β介導的上皮-間質轉化和細胞遷移的關鍵因素。miR-449家族通過阻止TGF-β介導的SOX4過表達來干擾TGF-β途徑，從而抑制細胞遷移[36]。

2.5 微環(huán)境與HCC轉移已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對于多種癌癥的轉移是至關重要的。雖然之前的研究主要集中在miRNA對癌細胞內在特性的影響，但最近的報道顯示，miRNA也可影響癌細胞與其相關基質之間的相互作用。

在癌癥的早期階段，上皮樣癌細胞分泌各種生長因子活化成纖維細胞、降低MMPs表達，使癌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)降解減緩，細胞基質硬度增加。活化的成纖維細胞還能通過調控胰島素樣生長因子、角化細胞生長因子等促進腫瘤細胞生長、抑制凋亡。之后，成纖維細胞表現(xiàn)出肌成纖維細胞的特征，激活TGF-β通路等促進細胞發(fā)生EMT，并產(chǎn)生FGF-2等因子促進血管生成。此外，CAF還上調賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)表達、分泌膠原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅸ形成膠原纖維，進一步重塑和增強ECM。由于過度的增殖和生長，腫瘤核心區(qū)域開始缺氧，癌細胞分泌血管內皮生長因子和結締組織生長因子增加，增強血管生成并向周圍浸潤。當癌細胞發(fā)生EMT時，會產(chǎn)生CSF-1，吸引巨噬細胞至腫瘤部位，產(chǎn)生EGF，IL-33等進一步促進轉移。在腫瘤邊緣，基質細胞還會排列成膠原束，腫瘤細胞經(jīng)此向周圍轉移。到了后期，癌細胞反而會上調基質金屬蛋白酶、解聚素-金屬蛋白酶等表達，降解基質，從而滲入淋巴結和血管向遠處轉移。

LOX是一種分泌的銅依賴性胺氧化酶，其在翻譯后催化ECM中膠原蛋白或彈性蛋白交聯(lián)。LOX氧化膠原，使肽基賴氨酸和羥基賴氨酸殘基脫氨基形成肽氨基己二酸半醛(烯丙基)，隨后凝聚。賴氨酰氧化酶樣(LOXL)1-4蛋白與LOX作用類似。LOXL2介導的ECM重塑導致ROCK的活化并隨后增強HCC局部侵襲。miR-26和miR-29協(xié)同抑制LOXL2表達，而這兩種miRNA在發(fā)生轉移的HCC中明顯下調。此外miR-26和miR-29不僅在HCC中失調，而且在其他癌癥中也被失調。最近在乳腺癌中證實，GATA結合蛋白3介導的miR-29b抑制了一組前轉移基因，這些基因主要為HIF靶點[37]。

IL-34鑒定為miR-28-5p的直接靶標，miR-28-5p可抑制IL-34的分泌。IL-34被HCC細胞分泌至細胞外后，與細胞膜上CSF-1R結合，激活局灶性黏附激酶和細胞外信號相關的激酶1和2(ERK1/2)，吸引巨噬細胞作趨化性遷移，聚集至腫瘤細胞附近。招募的腫瘤相關巨噬細胞(tumour-associated macrophages,TAM)分泌各種生長因子、血管生成因子和MMPs等，增強腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移能力，還可促進腫瘤血管生成。同時，TAM可通過TGF-β途徑進一步抑制miR-28-5p的成熟，形成一個正反饋環(huán)[38]。

3 結 語

綜上所述, 本文著重總結了Wnt、TGF-β信號通路和包括miR-200家族在內的miRNA 在HCC轉移過程中的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2萬多種miRNA，其中與腫瘤相關的miRNA有近千種，但還存在著其他未被發(fā)現(xiàn)的信號通路或新的miRNA參與腫瘤的轉移。并且這些信號通路及miRNA之間存在著更為復雜的協(xié)同或拮抗效應，這些都是需要我們更深入地研究。這些研究可增加我們對腫瘤侵襲和轉移機制的理解, 從而開發(fā)新的腫瘤治療方法，為提高患者生存率提供新的希望。