親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飲用水中的4種甜味劑

劉向凌，劉洪忠，王鵬坤，馬 斐

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 德州 253000)

人工甜味劑(Artificial sweeteners)以其甜度高，成本低，無(wú)熱量等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。令人擔(dān)憂的是，甜味劑的長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致葡萄糖耐受不良以及腸道菌群失調(diào)[1]；一些流行病學(xué)研究認(rèn)為膀胱癌可能與糖精鈉，甜蜜素的超量使用有關(guān)[2]；安賽蜜可能導(dǎo)致DNA損傷[3]。更為嚴(yán)峻的是，多篇文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在多個(gè)國(guó)家污水，自然水體，甚至飲用自來(lái)水中發(fā)現(xiàn)了人工合成甜味劑[4-5]，Scheurer[6]發(fā)現(xiàn)由于甜蜜素，糖精鈉，安賽蜜，三氯蔗糖這4種甜味劑極性大，水溶解性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，自來(lái)水生產(chǎn)過(guò)程中的凝絮沉淀工藝和氯處理對(duì)其幾乎沒(méi)有效果，所以進(jìn)入飲用水的風(fēng)險(xiǎn)很高。

因此有必要建立同時(shí)測(cè)定飲用水中上述四種甜味劑的檢測(cè)方法，對(duì)飲用水進(jìn)行科學(xué)監(jiān)管，避免對(duì)人民群眾的身體健康造成不必要的損害。由于水體中甜味劑含量較低，常常須采用如質(zhì)譜法等靈敏度較高的方法進(jìn)行檢測(cè)。桂建業(yè)等[7]采用離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水體中的甜味劑進(jìn)行了檢測(cè)，受限于接口技術(shù)，不能充分發(fā)揮聯(lián)用的優(yōu)勢(shì)。Scheurer[7]采用柱后三羥甲基氨基甲烷(TRIS)加強(qiáng)離子化串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水體中的人工甜味劑，由于柱后離子化試劑的使用，提高了檢驗(yàn)的靈敏度。但上述方法需要特殊的設(shè)備，并且TRIS可能會(huì)長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致質(zhì)譜正離子掃描模式靈敏度變差。

親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以顯著提高極性化合物的檢測(cè)靈敏度。作者采用亞乙基橋雜化硅膠顆粒親水作用色譜柱(BEH HILIC)對(duì)水體中上述四種甜味劑進(jìn)行分離，串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。甜蜜素，安賽蜜檢出限50 pg/mL，糖精鈉檢出限250 pg/mL，三氯蔗糖檢出限5 ng/mL。在定量限至10倍定量限濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R≥0.997，在定量限，2倍定量限，5倍定量限三個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，4種甜味劑回收率完全滿足檢驗(yàn)需求。對(duì)于評(píng)估飲用水來(lái)源污染風(fēng)險(xiǎn)，控制飲用水品質(zhì)有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，對(duì)于服務(wù)食品安全監(jiān)管具有一定的實(shí)用意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器，試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS，Waters Acquity H-class UPLC，Waters Xevo TQD)，Waters；BEH HILIC色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，Waters。

乙腈(ACN，LC-MS)，Merck；超純水(Millpore)；PTFE濾膜(0.22 μm，PAL)。

安賽蜜(Acesulfame Potassium)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，三氯蔗糖(Sucralose)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，糖精鈉(Saccharin Sodium)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，甜蜜素(Sodium cyclamate)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度≥99%，均購(gòu)自北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：水；流動(dòng)相流速0.2 mL/min，流動(dòng)相梯度0～1 min，90%A，1～3 min 90%～40%A，3～5 min 40%A，5.01～7 min，90%A。

質(zhì)譜掃描模式：MRM，參數(shù)見(jiàn)表1。離子源參數(shù)：ESI-，Capillary(KV)：2.50，RF(V)：2.5，Extractor(V)：3.00，Source Temperature(℃)：150，Desolvation Temperature(℃)：400，Cone Gas Flow(L/Hour)：50，Desolvation Gas Flow(L/Hour)：700。

表1 4種甜味劑MRM方法參數(shù)

1.3 前處理方法

稱取1 g水樣(精確至0.01 g)，置于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，經(jīng)PTFE濾膜過(guò)濾后，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

由于四種甜味劑極性較強(qiáng)，選取了2種色譜柱進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別為HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)色譜柱[8]和BEH HILIC(2.1×50 mm，1.7 μm)色譜柱，T3色譜柱降低了C18鏈配基密度，從而增強(qiáng)了對(duì)極性物質(zhì)的保留能力，HILIC柱為親水相互作用色譜柱，適用于極性物質(zhì)的分離。流動(dòng)相為乙腈和水，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度100 ng/mL進(jìn)樣量為2 μL，經(jīng)上述兩種色譜柱分離后，4種甜味劑總離子流圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 4種甜味劑總離子流圖(HSS T3色譜柱)

圖2 4種甜味劑總離子流圖(HILIC色譜柱)

HSS T3色譜柱對(duì)上述四種甜味劑分離效果尚可，安賽蜜出現(xiàn)了拖尾，各物質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)度5000～50000，HILIC色譜柱各物質(zhì)出峰時(shí)間較短，峰型較為對(duì)稱，響應(yīng)強(qiáng)度10000～1200000，與HSS T3色譜柱相比，安賽蜜，糖精鈉，甜蜜素響應(yīng)強(qiáng)度有了很大程度的提高。其原因是，使用HILIC色譜柱時(shí)，在ESI離子源中。高比例的有機(jī)相更有利于液滴的蒸發(fā)，從而提高離子化效率[9]。因此選用HILIC色譜柱作為分析用色譜柱。

2.2 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)[10]表明，使用HILC色譜柱時(shí)，在流動(dòng)相中添加適量的緩沖鹽有助于色譜柱硅膠顆粒表面“富水層”的形成，從而增強(qiáng)對(duì)極性物質(zhì)的保留，避免產(chǎn)生保留時(shí)間漂移。因此本文對(duì)比了乙腈/水，乙腈/水(含10 mmol/L甲酸銨)，乙腈/水(含10 mmol/L乙酸銨)，乙腈/水(含20 mmol/L乙酸銨)四種流動(dòng)相體系。進(jìn)行了3次批間實(shí)驗(yàn)，每批進(jìn)樣50次，考察四種化合物響應(yīng)強(qiáng)度，批間最大保留時(shí)間漂移。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同流動(dòng)相4種甜味劑質(zhì)譜靈敏度及保留時(shí)間漂移

使用緩沖鹽后，各物質(zhì)批間最大保留時(shí)間漂移低于僅使用乙腈/水，說(shuō)明各物質(zhì)的保留依賴于硅膠顆粒表面“富水層”的形成。但是響應(yīng)強(qiáng)度有了顯著的降低，經(jīng)過(guò)3次批間實(shí)驗(yàn)，未使用緩沖鹽的保留時(shí)間漂移最高僅為0.1 min，完全可滿足實(shí)驗(yàn)需要，因此使用乙腈/水作為流動(dòng)相。

2.3 凈化方法的選擇

雖然飲用水較為潔凈，但仍含有一定量的無(wú)機(jī)鹽，細(xì)菌以及不溶性微粒。這些物質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響檢驗(yàn)靈敏度，堵塞色譜柱。為減少這些物質(zhì)對(duì)檢驗(yàn)的影響，應(yīng)當(dāng)對(duì)水樣進(jìn)行凈化處理。由于4種甜味劑極性較強(qiáng)，難以在基于反相色譜原理的固相萃取柱上實(shí)現(xiàn)保留，因此本實(shí)驗(yàn)采用基于親水親脂平衡原理的HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，首先以3 mL甲醇，3 mL水活化60 mg Waters HLB固相萃取柱。稱取1 g(精確至0.01 g)水樣，加載至活化后的固相萃取柱上，以1滴每秒的速度過(guò)柱，然后以3 mL純化水淋洗，以3 mL 乙腈洗脫，將洗脫液在40 ℃水浴條件下以氮?dú)饩従彺抵两?，?0%乙腈水溶液(v/v)溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm PTFE濾膜過(guò)濾后，供UPLC-MS/MS測(cè)定。作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，取1 g水樣置于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，經(jīng)0.22 μm PTFE濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS測(cè)定?？疾旎|(zhì)效應(yīng)和2倍定量限水平加標(biāo)回收率。結(jié)果如表3所示。

表3 兩種處理方法基質(zhì)效應(yīng)與回收率對(duì)比

使用HLB固相萃取柱對(duì)水樣進(jìn)行凈化，回收率，基質(zhì)效應(yīng)與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比，沒(méi)有顯著的優(yōu)勢(shì)，但操作更為繁瑣。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，樣品被稀釋，檢出限較高，但檢測(cè)靈敏度能夠滿足檢驗(yàn)的需求。綜合分析后，采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方法作為水樣的凈化方法。

2.4 濾膜的選擇

為避免濾膜對(duì)4種甜味劑的吸附，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了PVDF，PTFE，Nylon 66三種材質(zhì)濾膜對(duì)回收率的影響，以90%乙腈水溶液(v/v)，配制20 ng/mL的4種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別經(jīng)3種材質(zhì)濾膜過(guò)濾，測(cè)定含量，回收率結(jié)果如表4所示。

表4 不同濾膜過(guò)濾后4種甜味劑回收率

可以發(fā)現(xiàn)，PVDF對(duì)4種甜味劑均有一定程度的吸附，Nylon 66材質(zhì)對(duì)甜蜜素和安賽蜜有較強(qiáng)的吸附，PTFE對(duì)4種甜味劑幾乎無(wú)吸附，因此選用PTFE材質(zhì)濾膜。

3 方法學(xué)考察

分別對(duì)包裝飲用水，礦泉水，自來(lái)水進(jìn)行方法學(xué)考察。

3.1 檢出限，線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)

按1.3中處理方法，4種甜味劑檢出限，線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)如表5所示。

表5 方法檢出限，線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)

3.2 回收率及精密度

按1.3中處理方法4種甜味劑在不同基質(zhì)中回收率及精密度如表6～表8所示。

表6 包裝飲用水加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

表7 礦泉水加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

表8 自來(lái)水加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

由表6～表8可知，本方法完全可滿足包裝飲用水，礦泉水，自來(lái)水中4種甜味劑的檢驗(yàn)需求。

4 結(jié) 論

水體中甜味劑的檢測(cè)是評(píng)估水體污染風(fēng)險(xiǎn)，控制水體質(zhì)量的重要指標(biāo)。但是現(xiàn)階段檢測(cè)方法靈敏度均較低，或?qū)嵱眯暂^差，本文使用HILIC色譜柱對(duì)水體中最常見(jiàn)的4種甜味劑進(jìn)行了檢測(cè)，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，且處理方法簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。除應(yīng)用于飲用水外，本方法為環(huán)境水體中甜味劑的檢測(cè)也提供了一定的解決思路。