莪術油超聲提取工藝優(yōu)化及生物活性研究*

趙海燕，許 鈺，班穎芳，張義浩，蔡吉祥

(1 廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119；2 廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西 來賓 546119)

廣西莪術也稱桂莪術，為廣西莪術(CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)的干燥根莖，是廣西的道地藥材，其有行氣破血、消積止痛的功效[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)莪術油具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多種生物活性[3]?，F(xiàn)階段揮發(fā)油提取方法有水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、索氏提取法等[4-6]。超聲輔助提取法是通過機械振動產(chǎn)生能量在介質中傳播而使物質分子發(fā)生碰撞產(chǎn)生新物質的過程，該方法是一項易掌握，較為安全、提取溫度低、時間快、提取率相對高的新技術，已廣泛應用于中草藥油脂的提取[7-9]。本實驗利用超聲輔助提取法，通過單因素和正交實驗優(yōu)化了廣西莪術揮發(fā)油提取工藝，并分析了揮發(fā)油的抗氧化和抗菌活性，以期為莪術油進一步開發(fā)利用提供基礎理論參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

廣西莪術購自亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經(jīng)廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室張鵬博士鑒定為廣西莪術。DPPH購自上海思誠化工科技有限公司；鐵氰化鉀、乙醇、雙氧水等試劑均為分析純，購自武漢長城化成科技發(fā)展有限公司；枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌來自廣西科技師范學院實驗樓微生物實驗室。

1.2 實驗儀器

RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(III)型循環(huán)水多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司；BILON-S6多頻恒溫超聲波提取機，上海比朗儀器制造有限公司；UV-9600型紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 超聲輔助提取工藝優(yōu)化方法

2.1.1 超聲輔助提取揮發(fā)油方法

將烘干的莪術粉碎后過60目篩，準確稱取過篩的莪術粉末20.0 g于500 mL燒杯中，加入一定量的無水乙醇，混勻后放入多頻恒溫超聲波提取器中，以一定的功率提取一定時間后，抽濾數(shù)次至濾紙無殘渣，濾液倒入已稱重的圓底燒瓶內，在旋轉蒸發(fā)儀上揮干溶劑，于恒溫干燥箱中干燥后冷卻至室溫稱重，按以下公式計算提取率：

(1)

式中m1為莪術粉質量；m2為空瓶質量；m3為莪術油加瓶總質量。

2.1.2 單因素實驗

利用超聲輔助提取法，分析無水乙醇與莪術粉的比例(A)、超聲功率(B)和提取時間(C)三個因素對揮發(fā)油提取率的影響。單因素梯度設為：無水乙醇與莪術粉的比例依次為9:1、12:1、15:1、18:1、21:1 mL/g；提取時間分別設為5、10、15、20、25 min；超聲功率設定為600、700、800、900、1000、1100、1200 W。每個單因素用料量為20 g。選定一組單因素條件實驗后，其他因素條件逐一進行實驗。

2.1.3 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果每個因素選擇3個水平進行正交實驗。正交實驗后通過極差分析得出超聲輔助提取廣西莪術揮發(fā)油的最佳提取條件。

2.2 體外抗氧化活性測定方法

2.2.1 還原能力測定

由于還原能力的強弱可以反映藥物潛在的抗氧化性能，因此首先對分離的揮發(fā)油進行了還原能力測定。分別取2.0 mL樣品溶液或對照品(Vc)溶液(6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)依次加入等體積的pH 6.6磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻后在50 ℃水浴中保溫大約20 min。再加入2.0 mL的10%的三氯乙酸溶液。取3.0 mL上述混合液，加入等體積去離子水和0.6 mL的0.1% FeCl3溶液，靜置10 min以后。在700 nm下測定各樣品的吸光值。測得的吸光值越大說明樣品的還原能力越強[10]。

2.2.2 清除DPPH自由基能力測定

在10.0 mL 60 μmol/L的DPPH·乙醇溶液中加入2.0 mL 樣品或對照品(Vc)溶液，25 ℃放置30 min后在517 nm測得吸光值[9]。自由基清除百分率SE(%)按下式計算。

(2)

式中A0是溶劑為空白的吸光值；AX為加入了樣品或對照品溶液的吸光值；AY為乙醇代替顯色劑時樣品或對照品的吸光值。

2.2.3 清除羥基自由基(·OH)能力測定

本實驗采用Fenton法[10-11]測定超聲輔助提取的莪術揮發(fā)油對羥基自由基的清除能力。樣品和對照品Vc的濃度依次設定為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。對·OH的清除率SE(%)按(2)式計算。其中A0為以溶劑代替樣品或對照品的試劑空白吸光值。

2.3 抗菌活性測定方法

本實驗采用濾紙片擴散法[13]對超聲輔助提取的莪術油的抗菌活性進行研究。先取200 μL濃度為105～106cfu/mL的菌懸液于干凈無菌空皿上，將熔化冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基快速倒入并水平轉動與菌懸液混勻。待混合皿凝固后，用滅菌過的鑷子取出浸有樣液的濾紙片，選好距離放在混合皿上，每組設陽性對照樣片，陰性對照樣片。貼好濾紙片后倒置放入培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h后，測量各抑菌圈的大小。按照抑菌圈直徑d>15 mm為抑菌敏感，15 mm>d>7 mm為有抑菌效果，d<7 mm為無抑菌效果，分別記錄各樣品組和陽性對照組的實驗結果。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 液料比對揮發(fā)油提取率的影響

從圖1中可以看出在提取時間15 min、超聲功率1000 W時，不同液料比對揮發(fā)油提取率的影響。液料比小于15:1 mL/g時，液料比增大提取率不斷升高；當液料比大于15:1 mL/g時，提取率開始下降。結果表明最佳液料比為15:1 mL/g時，揮發(fā)油的提取率為4.21%。

圖1 液料比對揮發(fā)油提取率的影響

3.1.2 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

根據(jù)上述單因素實驗結果，選擇在液料比15:1 mL/g和超聲功率為1000 W時，測定超聲時間對提取率的影響，實驗結果(見圖2)表明隨著超聲波提取時間的延長提取率逐漸增大但是超過15 min后提取率的增加并不顯著。從整體工藝的效率考慮確定了最佳提取時間為15 min，此時提取率為4.28%。

圖2 超聲提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

3.1.3 超聲波功率對揮發(fā)油提取率的影響

從圖3可以看出，在液料比為15:1 mL/g和超聲提取時間為15 min時，莪術油的提取率隨著超聲波提取功率的增加先增大后減小。在超聲功率小于1000 W時，超聲功率越大超聲機械振動頻率越大，物質分子降解能力越強，莪術油的提取率也越高，但是當超聲功率超過1000 W后，提取率基本不再增加甚至有下降的趨勢，可能是因為超聲功率過大時揮發(fā)油收集效率受到一定影響。當超聲波提取功率為1000 W時提取率為4.30%。

圖3 超聲波功率對揮發(fā)油提取率的影響

3.2 正交實驗結果

根據(jù)單因素實驗結果設計正交實驗表，如表1所示。

表1 正交實驗水平因素表

按照正交實驗表實驗后得到正交實驗結果見表2。

表2 正交實驗結果表

正交實驗結果顯示最佳工藝條件組合為A2B3C2。此組合與正交表中最佳水平條件組合A3B3C2不一致。因此按照A2B3C2條件重新測定了超聲提取揮發(fā)油的含量，最后得提取率為4.35%。于是確定最佳工藝條件為液料比15:1 mL/g，超聲功率1000 W，超聲時間20 min。

3.3 生物活性

3.3.1 還原能力測定結果

從圖4可以看出揮發(fā)油在一定濃度范圍(6.25 μg/mL～200 μg/mL)內的還原能力隨著樣品濃度增大還原性不斷增強，并且可知揮發(fā)油的還原性僅次于陽性對照品Vc。

圖4 還原能力測定曲線圖

3.3.2 清除自由基能力測定結果

圖5 揮發(fā)油和Vc對DPPH·、·OH和清除率(%)的影響

3.3.3 抗菌活性結果

本實驗采用抑菌圈法分析的揮發(fā)油對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌作用結果(表3)顯示莪術油濃度為1.5 mg/mL時對三種均都有一定的抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用較好。當濃度為2.0 mg/mL時對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有較明顯的抑制作用。

表3 抑菌結果匯總表

4 結 論