連續(xù)性腎臟替代治療對(duì)急性腎損傷患者自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及預(yù)后的影響

呂昕， 唐文學(xué)， 郭亮

連續(xù)性腎臟替代治療對(duì)急性腎損傷患者自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及預(yù)后的影響

呂昕， 唐文學(xué)△， 郭亮

（杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310000）

探討連續(xù)性腎臟替代治療（CRRT）對(duì)急性腎損傷（AKI）患者自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及預(yù)后的影響。選取2015年2月~2018年3月于杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共計(jì)174例。比較CRRT治療前后患者血漿白細(xì)胞介素1β （IL-1β）和白細(xì)胞介素6 （IL-6）蛋白水平及血單核細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II （LC3-II）、自噬相關(guān)蛋白5 （Atg5）和beclin-1的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析上述分子的表達(dá)水平與患者血清肌酐（SCr）的相關(guān)性。根據(jù)治療4周后的生存情況，將入選患者分為死亡組（=43）和生存組（=131），對(duì)兩組患者上述指標(biāo)的水平進(jìn)行比較。CRRT后，患者外周血的IL-1β、IL-6和SCr水平均較治療前顯著下降（<0.05）， LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低（<0.05）。死亡組患者LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)水平顯著高于生存組（<0.05）。IL-1β、IL-6、LC3-II和beclin-1的表達(dá)水平與SCr呈正相關(guān)（<0.05），然而Atg5的表達(dá)水平與SCr無(wú)顯著相關(guān)性（>0.05）。CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關(guān)分子的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而降低自噬水平，對(duì)AKI患者發(fā)揮保護(hù)性作用。自噬相關(guān)分子的mRNA可作為預(yù)測(cè)CRRT預(yù)后的重要指標(biāo)。

急性腎損傷；連續(xù)性腎臟替代治療；自噬；炎癥因子；預(yù)后

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是重癥監(jiān)護(hù)病房常見(jiàn)的疾病，連續(xù)性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy， CRRT）是目前臨床上治療AKI最常用且最為有效的治療手段之一［1］。細(xì)胞自噬能夠清除受損的細(xì)胞，但也能調(diào)控炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)，在AKI中發(fā)揮著重要的作用［2-3］。 CRRT能夠有效清除患者血液中的炎癥因子，但其對(duì)自噬活性的影響尚未被揭示，缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。本次研究旨在探討CRRT對(duì)AKI患者外周血自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及預(yù)后的影響，進(jìn)一步研究CRRT對(duì)AKI的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1　一般資料

選取2015年2月~2018年3月在杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共174例，引起AKI的原發(fā)病包括重癥急性胰腺炎（49例）、膿毒血癥（29例）、嚴(yán)重創(chuàng)傷及創(chuàng)傷術(shù)后（28例）、惡性腫瘤切除術(shù)后（20例）、骨科手術(shù)術(shù)后（9例）、心胸外科手術(shù)術(shù)后（24例）和腦出血術(shù)后（15例）。其中男性99例，女性75例，年齡26~75歲，平均（54.39±10.37）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）符合國(guó)際改善全球腎臟病預(yù)后組織（Kidney Disease Improving Global Outcomes， KDIGO）公布的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；（3）無(wú)腎臟毒性藥物服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在本次診斷前已接受CRRT；（2）患者或其代理人不同意參與本實(shí)驗(yàn)研究；（3）臨床資料不完整；（4）合并肝硬化、自身免疫性疾病、抑郁癥等疾病。所有患者均接受CRRT治療，具體采用連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過(guò)（continuous veno-venous hemofiltration， CVVH）模式。預(yù)沖液為0.9％氯化鈉3 000 mL加入普通肝素100 mg，預(yù)沖時(shí)間30 min。血流速度控制在100～200 mL/min，治療劑量不低于35 mL·kg-1·h-1。治療4周內(nèi)死亡（均因多臟器功能衰竭死亡）的患者共計(jì)43例，納入死亡組，其余131例患者納入生存組。死亡組中，男性27例，女性16例，平均年齡（55.04±9.48）歲，平均身高為（168.5±11.4） cm，平均體重為（63.4±6.4） kg，體重指數(shù)（body mass index， BMI）為（25.6±3.4） kg/m2， APACHE II評(píng)分為12.6±3.8， SOFA評(píng)分為6.8±2.1；生存組中，男性72例，女性59例，平均年齡（54.03±9.74）歲，平均身高為（169.4±9.7） cm，平均體重為（61.2±5.3） kg， BMI為（23.4±2.7） kg/m2， APACHE Ⅱ評(píng)分為12.1±1.8， SOFA評(píng)分為6.2±1.6。兩組患者的性別、年齡、身高、體重、BMI、APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。本次研究經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

2　方法

2.1外周血白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素6 （interleukin-6，IL-6）水平的檢測(cè)在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL，置于抗凝管內(nèi)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測(cè)血漿中IL-1β和IL-6的水平，其中IL-1β由Abcam提供的人IL-1β ELISA試劑盒（貨號(hào)ab46052）進(jìn)行檢測(cè)， IL-6由Thermo Fisher Scientific提供的人IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)：EH2IL6）進(jìn)行檢測(cè)。

2.2血清肌酐（serum creatinine， SCr）水平的檢測(cè)在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL， 3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用由貝克曼庫(kù)爾特公司提供的AU680全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)患者SCr的含量。

2.3自噬相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血5 mL，置入肝素抗凝管內(nèi)，加入等量的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（北京同立海源生物科技有限公司），于室溫500×離心20 min，吸取最上層血漿，收集血漿層與淋巴細(xì)胞分離液交界面的單核細(xì)胞。加入1倍體積的含有5×103U/L肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液， 200×離心10 min，吸取上清液，重復(fù)洗滌2次，用1%臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，細(xì)胞活力應(yīng)>95%，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將單核細(xì)胞儲(chǔ)存于-80℃。在冷凍的單核細(xì)胞中加入Trizol溶液（Thermo Fisher Scientific），嚴(yán)格按照Trizol溶液的說(shuō)明書(shū)提取單核細(xì)胞中的RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量。吸取1 μg合格的RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix （TaKaRa）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System （Thermo Fisher Scientific）上進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II （microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）、自噬相關(guān)蛋白5 （autophagy-related protein 5， Atg5）和beclin-1的mRNA表達(dá)量。PCR條件為： 94℃ 1 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)孔重復(fù)4次，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4觀察指標(biāo)比較第1次CRRT前和多次CRRT后AKI患者血漿IL-1β和IL-6蛋白水平，以及血單核細(xì)胞中LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析上述分子水平與SCr含量的關(guān)系。同時(shí)對(duì)CRRT治療28 d后的生存組和死亡組患者上述基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 for Mac軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示，組間采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行比較，CRRT前后比較采用配對(duì)樣本檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)（率）的形式表示，組間采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較；指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson’s相關(guān)性分析進(jìn)行研究。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平的比較

CRRT后，所有患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平均比治療前顯著下降（<0.05），見(jiàn)表2。

2　CRRT前后AKI患者單核細(xì)胞中自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

CRRT后AKI患者單核細(xì)胞中IL3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)水平均比治療前顯著降低（<0.01），見(jiàn)表2。

表2　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平及單核細(xì)胞中自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

**<0.01before CRRT.

3　CRRT后生存組和死亡組患者自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

死亡組患者治療后LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)水平均顯著高于生存組（<0.05），見(jiàn)表3。

表3　生存組和死亡組患者CRRT后自噬相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的比較

**<0.01survival group.

4　IL-1β、IL-6和自噬相關(guān)分子表達(dá)水平與SCr含量的相關(guān)性分析

AKI患者IL-1β （=0.79，=0.032）、IL-6 （=0.66，=0.003）、LC3-II （=0.54，=0.019）和beclin-1 （=0.63，=0.042）水平與SCr含量均呈正相關(guān)，而Atg5表達(dá)水平與SCr含量無(wú)顯著相關(guān)性（=0.64，=0.328）。

討論

AKI是指突發(fā)且持續(xù)的腎功能下降，臨床表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)紊亂、少尿等。AKI的病因可分為腎前性、腎性和腎后性，其中腎前性AKI是臨床最為常見(jiàn)的類(lèi)型，主要是由于全身循環(huán)血量減少導(dǎo)致的腎灌注不足，造成腎功能的損害。臨床上對(duì)于AKI的治療包括去除病因、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)支持、處理并發(fā)癥及給予腎臟替代治療（renal replacement therapy， RRT）。CRRT是危重患者最常用的血液凈化技術(shù)，其主要原理是通過(guò)模仿腎小球的濾過(guò)，運(yùn)用對(duì)流、彌散和對(duì)流的原理，清除溶質(zhì)。與間斷血液透析相比， CRRT具有能夠穩(wěn)定血液動(dòng)力學(xué)、較高的溶質(zhì)清除率、清楚炎性介質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)［5-6］。既往的研究顯示，接受CRRT的危重患者的死亡率約為50%左右，而AKI患者接受CRRT的預(yù)后受到啟動(dòng)時(shí)間、治療前血中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）水平、APACHE II評(píng)分、炎癥因子水平等的影響［7-9］。

自噬是細(xì)胞代謝和更新的必要過(guò)程，也是幫助細(xì)胞在嚴(yán)酷環(huán)境下存活的重要生理過(guò)程，同時(shí)自噬也是細(xì)胞凋亡的重要途徑。既往的研究發(fā)現(xiàn)，自噬體在維持腎臟功能、保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞不受損傷等環(huán)節(jié)起到重要的作用［10-11］，但對(duì)于接受CRRT的AKI患者體內(nèi)自噬相關(guān)分子表達(dá)及意義的研究極為欠缺。自噬是一種參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和大分子物質(zhì)降解的生理行為，且可通過(guò)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待被降解的物質(zhì)形成自噬體，且將其轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬溶酶體發(fā)生降解作用。LC3-II是一種非常重要的自噬相關(guān)蛋白，往往代表自噬體的出現(xiàn)。LC3-II的累積能夠激活巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，釋放大量IL-1β、IL-6等炎癥因子，從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，組織損傷加重［12-13］。我們的研究結(jié)果顯示，CRRT能夠有效減少患者體內(nèi)IL-1β、IL-6等炎癥因子的聚集，同時(shí)亦能減少患者體內(nèi)LC3-II的表達(dá)，提示CRRT能夠有效抑制AKI患者的炎癥反應(yīng)和自噬，從而減少對(duì)腎臟的傷害。此外， beclin-1是另一種常見(jiàn)的具有自噬活性的分子，它作為PI3K復(fù)合體中的一部分，參與自噬體的形成，還能調(diào)節(jié)Atg蛋白的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬［14-15］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠發(fā)生AKI后，自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)明顯上調(diào)，且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)， beclin-1的表達(dá)水平逐漸升高［16］。我們的研究結(jié)果顯示， CRRT亦能夠有效降低beclin-1和Atg5的水平，提示CRRT能夠抑制自噬。通過(guò)比較不同預(yù)后的患者治療后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)存活組患者體內(nèi)LC3-II、beclin-1和Atg5表達(dá)水平都顯著低于死亡組，即CRRT后死亡患者體內(nèi)的自噬情況無(wú)明顯改變，說(shuō)明在AKI患者中，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，較低的自噬水平可以預(yù)測(cè)患者治療后較好的預(yù)后。LC3-II和beclin-1作為自噬體膜的標(biāo)志蛋白，與細(xì)胞間的自噬和凋亡均有一定相關(guān)性，細(xì)胞的自噬和凋亡均可被應(yīng)激反應(yīng)所激活，兩者甚至可相互轉(zhuǎn)換。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，膿毒血癥大鼠的自噬體膜蛋白LC3-II和beclin-1表達(dá)水平明顯升高，并誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且自噬蛋白的表達(dá)水平與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)成正比［17］。本研究中，死亡AKI患者LC3-II和beclin-1的表達(dá)水平明顯高于存活患者，分析其原因可能是患者中高表達(dá)的LC3-II和beclin-1可提高細(xì)胞凋亡水平，不利于腎臟修復(fù)，最終導(dǎo)致患者死亡。本課題組后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證此機(jī)制。

綜上所述，CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平，降低自噬水平，對(duì)AKI患者發(fā)揮保護(hù)性作用。自噬相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)CRRT預(yù)后的重要指標(biāo)，這為臨床治療AKI提供了新理論和新思路。

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Effect of continuous renal replacement therapy on mRNA expression of autophagy-related molecules and prognosis in patients with acute kidney injury

Lü Xin， TANG Wen-xue， GUO Liang

（，，310000，）

To explore the effect of continuous renal replacement therapy （CRRT） on mRNA expression of autophagy-related molecules and the prognosis in the patients with acute kidney injury （AKI）.A total of 174 patients from our hospital who were diagnosed to have AKI and underwent CRRT between February 2015 and March 2018 were involved in this study. The plasma levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， the serum creatinine （SCr） level， and the mRNA expression levels of autophagy-related molecules， including microtubule-associated protein 1 light chain 3-II （LC3-II）， autophagy-related protein 5 （Atg5） and beclin-1， in the monocytes from peripheral blood were compared before and after CRRT. According to the survival of AKI patients after 4 weeks of CRRT， the enrolled patients were divided into death group （=43） and survival group （=131）， and the mRNA expression levels of the above molecules were compared between the 2 groups.After CRRT treatment， the plasma levels of IL-1β and IL-6， the level of SCr， and the mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in the monocytes were significantly lower than those before CRRT treatment （<0.05）. The mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in death group were significantly higher than those in survival group （<0.05）. The positive correlation between SCr and IL-1β， IL-6， LC3-II or beclin-1 was observed （<0.05）， and no correlation between SCr and Atg5 was found （>0.05）.CRRT decreases the mRNA expression levels of autophagy-related molecules in the patients with AKI and reduces the autophagy activity， which is protective for the patients. These autophagy-related molecules may be applied as a potential markers to predict the prognosis of CRRT.

Acute kidney injury； Continuous renal replacement therapy； Autophagy； Inflammatory factors； Prognosis

R692； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.023

1000-4718（2020）11-2081-05

2020-07-06

2020-10-23

Tel: 18922750968； E-mail： xufengqing09@163.com

（責(zé)任編輯：余小慧，羅森）