黃邊靈芝多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性的研究

宋志強，錢 葉，丁 祥，朱 淼，唐 賢，侯怡鈴*

(1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

0 引言

靈芝(GanodermaLucidum)為靈芝屬真菌的總稱，作為我國具有悠久歷史的名貴中草藥和食用菌，近年來，已被各國學(xué)者廣泛研究。靈芝多糖多來源于靈芝的子實體、菌絲體孢子粉中分離得到，是靈芝中的有效生物活性成分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖一般由葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖等成分所組成[2-6]，糖苷鍵鏈接形式大多為β-(1→3)鍵、β-(1→4)鍵、β-(1→6)鍵和α-(1→6)鍵等[7-9]。

大量藥理研究結(jié)果表明，靈芝多糖具有免疫調(diào)控作用，青海雪靈芝多糖與東莞紫芝多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性、NO釋放量，同時，東莞紫芝多糖還能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達(dá)[10-11]。不同地區(qū)的黑靈芝多糖在促進(jìn)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖的過程中具有不同程度的作用，相較于贛南的黑靈芝多糖，江西贛州的黑靈芝多糖對于提高血清中 IL-2 和 TNF-α含量發(fā)揮著重要作用[12-13]。同時，靈芝多糖也具有抗氧化、抗腫瘤作用，海南赤芝靈芝多糖具有較強的抗氧化能力[14]；安徽產(chǎn)靈芝多糖能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[15]。以上研究表明，不同產(chǎn)地，不同品種靈芝多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性有一定的差異，在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等方面有不同程度的療效。

四川省小金縣地處川西北高原，是長江、黃河源區(qū)的重要組成部分，地理位置獨特、生態(tài)戰(zhàn)略地位十分重要[16]。該地區(qū)地屬大陸性季風(fēng)高原型氣候，草甸和灌木叢繁茂，植被覆蓋面積較大，獨特的自然環(huán)境，造就了其生態(tài)環(huán)境、藥用植物資源物種及遺傳性狀的多樣性[17-18]，成為藏醫(yī)藥發(fā)展的重要搖籃[19]。采自于四川小金縣的野生靈芝子實體小，呈半圓形、近扇形或略圓形，表面呈暗褐色，有漆樣光澤和縱皺紋，有同心環(huán)紋但不明顯，木栓質(zhì)至木質(zhì)部位，呈淺黃至黃褐色。根據(jù)卯曉嵐[20]主編的《中國大型真菌》一書對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定為黃邊靈芝(G.luteomarginatum)(圖1)。目前，關(guān)于四川省小金縣野生黃邊靈芝的多糖結(jié)構(gòu)及免疫活性方面的研究還未見報道。

圖1 四川小金縣野生黃邊靈芝Fig.1 Wild Ganoderma luteomarginatum in Xiaojin County, Sichuan Province

本研究以四川小金縣野生黃邊靈芝為研究對象，采用熱水浸提技術(shù)、乙醇醇沉法、柱層析技術(shù)分離純化靈芝多糖，通過高效凝膠滲透色譜(HPGPC)，紅外光譜技術(shù)(IR)，核磁共振譜(1H NMR和13C NMR)等對小金縣野生靈芝多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征并探究靈芝多糖的免疫調(diào)控能力。通過此研究有助于開發(fā)利用四川小金縣野生黃邊靈芝多糖資源，并且為進(jìn)一步研究其免疫調(diào)控機制以及藥理作用方面提供理論參考的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

靈芝，四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣采集，經(jīng)西華師范大學(xué)環(huán)境工程與環(huán)境科學(xué)學(xué)院丁祥教授根據(jù)《中國大型真菌》一書進(jìn)行鑒定；T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠；DEAE纖維素，生興生物技術(shù)(南京)有限公司；無水乙醇，安徽安特生物化學(xué)有限公司；CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8)，上海碧云天生物技術(shù)研究所；PBS緩沖液，本實驗室提供；RPMI1 640培養(yǎng)基、無酚紅，美國gibco公司；0.5% Trypsin-EDTA，美國gibco公司；胎牛血清，Clark Bioscience；實驗藥品均為分析純。

1.1.2 主要實驗儀器

3 100 系列CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo公司； Epoch酶標(biāo)儀，美國基因有限公司；96孔微量培養(yǎng)板，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；AR 2130電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；LD4-2A型離心機，青島海爾股份有限公司；RE-2 000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HHS型恒溫水浴鍋，上海光地儀器設(shè)備有限公司；DMI 3 000徠卡倒置熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靈芝粗多糖的提取

稱取干燥的靈芝子實體250 g粉碎，以粉碎后靈芝子實體與蒸餾水1∶3的比例的在90 ℃條件下水浴6 h，煮3次；收集上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將靈芝多糖濃縮至200 mL，加入4倍體積的無水乙醇醇沉，對其進(jìn)行離心收集絮狀沉淀，沉淀反復(fù)凍融后除去不溶解雜質(zhì)，并采用sevage法脫去其中含有的蛋白，烘干后得到靈芝多糖的粗多糖[21-23]。

1.2.2 靈芝粗多糖的分離純化

精密稱取靈芝多糖的粗多糖10 mg，溶于10 mL蒸餾水中，將其在4 ℃，12 000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液，經(jīng)DEAE cellulose-52色譜柱[24]及SePHACE-S300凝膠柱[25]反復(fù)純化后，收集純化后的多糖溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL，透析，烘干后得到的多糖命名為靈芝多糖。靈芝多糖得率 =(靈芝多糖重量/子實體總重量)×100%

1.2.3 靈芝多糖的分子量測定

稱取5 mg靈芝多糖樣品，用1 mL蒸餾水溶解，使用高效凝膠滲透色譜法對靈芝多糖的分子量進(jìn)行測定[26]。測得的數(shù)據(jù)經(jīng)GPC軟件分析得到分子量[27]。

1.2.4 靈芝多糖的紅外光譜分析

稱取靈芝多糖樣品5 mg，與烘干后的KBr粉末一起充分研磨，壓片，用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1[28]的檢測范圍內(nèi)掃描檢測。

1.2.5 靈芝多糖的核磁共振分析

稱取靈芝多糖樣品20 mg溶解于D2O中，保存并在核磁共振儀上進(jìn)行測定， 600 MHz條件下測定1H NMR譜和13C NMR譜[29]。

1.2.6 靈芝多糖對T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

本實驗采用CCK-8試劑盒(cell counting kit)法測定靈芝多糖對T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞增殖實驗的影響[30]。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的靈芝多糖母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為(2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的靈芝多糖溶液。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的LPS母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，并配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的LPS溶液。

取T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，并用培養(yǎng)液稀釋至2×105細(xì)胞/mL，配制成細(xì)胞懸浮液。為了消除邊緣效應(yīng)，向96孔板的四周加入PBS緩沖液。再向其余的孔中分別加入100 μL的細(xì)胞稀釋液。在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(空白對照)、LPS(質(zhì)量濃度10 μg/mL，陽性對照)以及質(zhì)量濃度為(2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的靈芝多糖溶液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，每孔加入5 μL的CCK-8溶液，孵育3 h，在酶標(biāo)儀450 nm的波長下測定OD值，記錄并拍照、作圖。

1.2.7 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用社會科學(xué)統(tǒng)計項目(Statistical Program for Social Sciences)SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，與空白對照組對比顯著用*表示，P<0.05，極顯著用**表示，P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃邊靈芝多糖得率

本研究從250 g黃邊靈芝子實體中提取到56 g的靈芝粗多糖，將靈芝粗多糖進(jìn)一步分離純化后，提取到靈芝多糖1.44 g，在黃邊靈芝子實體總量中的得糖率為0.576%。

2.2 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)檢測結(jié)果

凝膠色譜技術(shù)作為一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。本實驗采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定靈芝多糖的分子量。結(jié)果如圖2所示，在14 min左右出現(xiàn)單一峰，曲線呈近似對稱分布的曲線。

圖2 黃邊靈芝多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 The high performance gel permeation chromatogram of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

多糖作為一種大分子高聚物，靈芝多糖的生理活性與分子量大小及分子量的分布密切相關(guān)。如圖3所示，通過高效凝膠滲透色譜測得的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的重均分子量Mw約為7. 96×103Da，是一種分子量較低的靈芝多糖。數(shù)均分子量Mn約為1. 05×103Da，分子量分布指數(shù)a為7.57，多分散系數(shù)為5.30，說明分子量的分布較寬。

圖3 黃邊靈芝多糖的分子量Fig.3 The molecular weight of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.3 黃邊靈芝多糖的FTIR譜分析

本研究采用傅里葉紅外光譜技術(shù)(FTIR)在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測定靈芝多糖的紅外吸收，并處理分析靈芝多糖的紅外光譜。如圖4所示，波數(shù)在3 438.90 cm-1處出現(xiàn)了一處寬吸收峰，并將此吸收峰指定為糖醇羥基O-H的伸縮振動吸收峰；1 637.54 cm-1的吸收峰則指定為羰基C=O 非對稱伸縮振動吸收峰；1 401.20 cm-1附近的吸收峰是糖醇羥基-C-OH的面內(nèi)彎曲振動，綜上描述了靈芝多糖在4 000～1 400 cm-1范圍內(nèi)的特征吸收峰。在1 250～1 000 cm-1指紋峰區(qū)域范圍內(nèi)的一組峰是由醚鍵C-O伸縮振動引起的，即在1 108.62 cm-1處所出現(xiàn)的吸收峰；在600～650 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰可用來確定吡喃糖環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)，因此根據(jù)619.33 cm-1峰的存在，我們可以推斷靈芝多糖中有吡喃糖作為其基本骨架[31]，紅外光譜結(jié)果還顯示此多糖成分均一，無其他結(jié)構(gòu)特征峰，是一種均一多糖。

圖4 黃邊靈芝多糖的傅里葉紅外光譜分析Fig.4 Fourier transform infrared spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.4 黃邊靈芝多糖的1H-NMR圖譜分析

四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的1H-NMR譜如圖5所示：在1H-NMR核磁共振譜中，靈芝多糖含有3個異頭氫信號，分別為δ4.98、δ4.91、δ4.44。表明靈芝多糖由3種單糖組成。δ4.98、δ4.91處的氫信號指示為α-吡喃糖殘基，而δ 4.44處的異頭氫信號指示為β-吡喃糖殘基[31]，積分曲線顯示兩種α-吡喃糖殘基與β-吡喃糖殘基比為2∶2∶1，所以四川小金縣野生黃邊靈芝多糖以α-型糖苷鍵為主鏈，β-型糖苷鍵為側(cè)鏈，主鏈與側(cè)鏈之比為4∶1。在δ3.20～ 4.12處的吸收峰為2～6位碳上氫信號的重疊峰。

圖5 黃邊靈芝多糖的1H-NMR譜數(shù)據(jù)Fig.5 1H-NMR spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.5 黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜分析

四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜如圖6所示：δ102.48、δ101.43、δ97.74處有異頭碳信號，δ102.48、δ101.43處表明四川小金縣野生黃邊靈芝多糖具有α構(gòu)型，且δ97.74處表明四川小金縣野生黃邊靈芝多糖具有β構(gòu)型。同時根據(jù)文獻(xiàn)[32]，δ97～104 之間的區(qū)域的碳信號，即δ102.48、δ101.43、δ97.74處的共振信號歸為D型吡喃型單糖的異頭碳原子，該靈芝多糖在異頭碳δ100～103之間的區(qū)域中，δ102.48、δ101.43可歸屬于α-D-糖殘基的C1；δ97.74可歸屬于β-D-糖殘基的C1。13C-NMR譜的碳信號與氫譜的1H-NMR氫信號結(jié)果相吻合。

圖6 黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜數(shù)據(jù)Fig.6 13C-NMR spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.6 黃邊靈芝多糖對T淋巴細(xì)胞的增殖作用

T淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多能干細(xì)胞，骨髓中的一部分多功能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。成熟的T細(xì)胞與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞，或者釋放淋巴因子，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等功能。由圖7可知，當(dāng)靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為1.25～10 μg/mL時，隨著藥物濃度的增加，T細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn) T 淋巴細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對照組具有極顯著性差異(P<0.01)。值得注意的是，當(dāng)終質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，相比于空白對照組呈現(xiàn)增殖效果，具有極顯著性差異(P<0.01)，但效果弱于1.25～10 μg/mL實驗組與LPS陽性對照組，提示低濃度的靈芝多糖促進(jìn) T淋巴細(xì)胞增殖的效果較好, 且在1.25～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與T淋巴細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

*. 與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖7 黃邊靈芝多糖對T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of T cells

本實驗的T淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)圖如圖8所示，結(jié)果顯示，空白組的T淋巴細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)為圓型，多為成團生長，且以10個細(xì)胞左右成團，加入四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激后，細(xì)胞成團量變大，細(xì)胞量逐漸增多，可達(dá)到幾十甚至上百個細(xì)胞成團。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激T淋巴細(xì)胞時，T淋巴細(xì)胞的成團量最大。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激T淋巴細(xì)胞時，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對于T淋巴細(xì)胞數(shù)量及成團量刺激也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實驗組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為LPS組(5 μg/mL)。圖8 黃邊靈芝多糖對T細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.8 Effect the cell morphology of T cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.7 黃邊靈芝多糖對B淋巴細(xì)胞增殖的影響

成熟的B淋巴細(xì)胞主要定居于淋巴結(jié)皮質(zhì)淺層的淋巴小結(jié)和脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結(jié)內(nèi)。B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可合成和分泌抗體，從而發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。由圖9可知，當(dāng)四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為2.5～10 μg/mL時，隨著藥物濃度的增加，B淋巴細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對照組具有極顯著性差異(P<0.01)；但當(dāng)終質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時，相比于空白對照組沒有明顯的增殖效果；值得注意的是，當(dāng)終質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，相比于空白對照組呈現(xiàn)增殖效果，具有顯著性差異(P<0.05)，但效果弱于2.5～10 μg/mL實驗組，高于LPS陽性對照組。提示中等濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的效果較好，且在2.5～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與B淋巴細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

注：*.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖9 黃邊靈芝多糖對B細(xì)胞增殖的影響Fig.9 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of B cells

本實驗的B淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)圖如圖10所示，結(jié)果顯示，空白組的B淋巴細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)為圓形，多為成團生長，且以10個細(xì)胞左右成團，加入四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激后，細(xì)胞成團量變大，細(xì)胞量逐漸增多，可達(dá)到幾十甚至上百個細(xì)胞成團。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激B淋巴細(xì)胞時，B淋巴細(xì)胞的成團量最大。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激B淋巴細(xì)胞時，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對于B淋巴細(xì)胞數(shù)量及成團量刺激也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實驗組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為LPS組(5 μg/mL)。圖10 黃邊靈芝多糖對B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.10 Effect the cell morphology of B cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.8 靈芝多糖對RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響

RAW264.7 是由 Abelson 鼠白血病病毒誘導(dǎo) BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后收集小鼠腹水單核樣巨噬細(xì)胞得到的細(xì)胞株,具有很強的黏附和吞噬抗原的能力，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[33]。如圖11所示，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為2.5～10 μg/mL時，隨著藥物濃度的增加，RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對照組具有極顯著性差異(P<0.01)；提示低濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的效果較好，且在1.25～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

注：*.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖11 黃邊靈芝多糖對巨噬細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響Fig.11 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of Macrophages cells

本實驗RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖形態(tài)如圖12所示。結(jié)果顯示，空白組的RAW264.7巨噬細(xì)胞為高折光圓形及部分細(xì)胞伸出偽足的狀態(tài)，貼壁生長。在四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的刺激下，RAW264.7巨噬細(xì)胞伸出偽足，進(jìn)行分裂，且細(xì)胞量逐漸增加。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞時，增殖效果最好，細(xì)胞數(shù)量增殖最多。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞時，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖作用也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實驗組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為LPS組(5 μg/mL)。圖12 黃邊靈芝多糖對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.12 Effect the cell morphology of Macrophages cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

3 討論

本研究從小金縣野生黃邊靈芝中提取到一種糖成分，重均分子量Mw約為7.9×103Da，數(shù)均分子量約為1.05×103Da，分子量分布指數(shù)a為7.57，多分散系數(shù)為5.30，是由50個左右的單糖所組成的均一多糖。結(jié)構(gòu)分析顯示，該多糖結(jié)構(gòu)特征明顯，由3種單糖構(gòu)成，具有α-D -吡喃糖主鏈，β-D-吡喃糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，且主鏈與側(cè)鏈比為4∶1，是一種結(jié)構(gòu)新穎的均一多糖。

結(jié)構(gòu)決定理化性質(zhì)，并且多糖的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)都與其活性緊密相關(guān)，然而兩者并非單獨地影響多糖的活性。分子量的大小是多糖具備生物活性的必要條件，根據(jù)文獻(xiàn)報道，一般多糖分子量大于10 kDa才具有較強的活性，小于該值則活性很低或沒有[7]。例如何晉浙等[34]從赤靈芝子實體中提取到分子量為8×104～2×105Da的靈芝多糖；劉艷芳等[35]從“滬農(nóng)靈芝1號”品種子實體中獲得分子量為2.28×106Da的靈芝多糖均具有較強的生物活性。而我們從四川小金縣野生黃邊靈芝中提取到的多糖分子量約為7.9×103Da，小于10 kDa，但該多糖免疫活性實驗結(jié)果顯示，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖仍然具有較強的生物活性。

除此之外，目前研究發(fā)現(xiàn)，大部分靈芝多糖以β-(1→3)糖苷鍵構(gòu)成主鏈，以β-(1→6)及β-(1→4)糖苷鍵構(gòu)成側(cè)鏈。劉艷芳[36]研究表明，從赤靈芝子實體中提取到的大分子量的β-(1→3)葡聚糖，具有較強的刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的活性。王琪[37]研究表明，從靈芝子實體及水提物提取到主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸以2∶4∶1∶2組成的多糖LZ5-S和主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和糖醛酸以2∶2∶1∶1組成的多糖LZ5-W-2-A具有刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用，并存在濃度依賴性。毛健[38]等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有β-(1→3)和1→6的主鏈結(jié)構(gòu)，并且具有提高細(xì)胞免疫及體液免疫的作用。向俊宇[2]等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有β-(1→3)的主鏈結(jié)構(gòu)，并且具有免疫調(diào)節(jié)作用。

不同品種的靈芝多糖不僅結(jié)構(gòu)會影響細(xì)胞的免疫活性方面，不同品種的靈芝多糖的濃度對免疫細(xì)胞增殖的效果也有所差異。連紫菀[39]等研究表明，在濃度范圍為25～100 μg/mL的雪靈芝多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，顯示出顯著的濃度依賴性刺激作用。顧菲菲[40]等研究表明，赤靈芝多糖在25～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都具有較高免疫調(diào)節(jié)活性。張麗霞等[41]研究表明，靈芝孢子粉多糖在50～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α效果較好，并產(chǎn)生劑量依賴效果。

與不同品種的靈芝多糖的構(gòu)效和量效比較后發(fā)現(xiàn)，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖不僅具有α主鏈結(jié)構(gòu)，同時具有β側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。同時多糖分支度與其生物活性有一定的關(guān)聯(lián)度，但并不呈線性關(guān)系。四川小金縣野生靈芝多糖的主鏈與側(cè)鏈比為4∶1，提示每四個單糖就有一個分支，分支較多。免疫活性實驗顯示，四川小金縣野生靈芝多糖在1.25～20 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠有效地促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。并且，當(dāng)靈芝多糖終質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞RAW264.7的成團增殖的效果最好。我們的研究結(jié)果表明β構(gòu)型的主鏈結(jié)構(gòu)并不是多糖活性的必需基團，α構(gòu)型的主鏈結(jié)構(gòu)也具有較強的免疫活性。并且與其它品種的靈芝多糖相比較發(fā)現(xiàn)，本研究中的黃邊靈芝多糖在較低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的效果最好。

綜上研究為開發(fā)和利用四川小金縣野生黃邊靈芝提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但關(guān)于四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定及免疫調(diào)控作用的相關(guān)分子機制還有待于進(jìn)一步研究。